谷氨酸棒杆菌中脂肪酸的合成机制及调控研究

Bio-based free fatty acid has received significant attention for producing high-energy density, liquid transprotation fuels and high-value oleochemicals from renewable feedstocks. However, its biosynthesis research has just begun and its theoretical study of the regulation and synthesis mechanism was relatively weak. The efficient genetic engineering strains were difficult to be constructed. The mechanism of fatty acid synthesis and regulatory would be confirmed in Corynebacterium glutamicum by bioinformatic approaches and molecular biology techniques. To investigate the relationship between the key enzyme and fatty acid synthesis, we analyze the effect of transcriptional level caused by transcription factor. In addition, we identify the function of three putative acyl-CoA thioesterases genes. The catalytic mechanism of thioesterase would be explored in Corynebacterium glutamicum through the parameters such as the production and distribution of the products. We construct a functional reversal β-oxidation cycle and design the biological modules by assembling and rearranging the related.genes. This work provides the meaningful theoretical support for the effective genetic engineered strains construction for fatty acid production.

生物基游离脂肪酸在高能比液体燃料和高附加值油脂化学品生产中具有广泛的应用前景。但其研究尚属起步阶段，在调控及合成机制方面的理论基础相对薄弱，制约了高性能菌株的遗传改造。本课题以谷氨酸棒杆菌为研究对象，运用现代生物工程手段，针对谷氨酸棒杆菌脂肪酸的合成机制及脂酰CoA反馈阻遏效应的解除等开展深入研究，试图从分子水平阐明转录调控因子对脂肪酸合成关键酶转录水平的影响，解析硫酯酶与脂肪酸产率及分布类型的关系；此外，通过在胞内构建反β氧化途径，对相关基因进行组装与重排，设计生物模块，优化脂肪酸合成效率。本课题预期为构建高效合成脂肪酸的基因工程菌株提供坚实的理论依据。

生物基游离脂肪酸在高能比液体燃料和高附加值油脂化学品生产中具有广泛的应用前景。但其研究尚属起步阶段，在调控及合成机制方面的理论基础相对薄弱，制约了高性能菌株的遗传改造。本项目通过转录组学分析了谷氨酸棒杆菌ATCC13032脂肪酸代谢通路相关基因表达量的变化规律，阐明了脂肪酸合成机制。解除调控因子fasR对脂肪酸合成产生的负调控作用后发现accD1，accBC和fasA是基因fasR调控的关键蛋白。通过考察FAS系统中脂肪酸合成关键基因accBCD1、accBC、accD1、fasA的过量表达对细胞合成脂肪酸能力的影响，筛选出accBC和accD1是谷氨酸棒杆菌中脂肪酸合成途径的关键酶，并确定了重组谷氨酸棒杆菌的脂肪酸合成的最优条件。基于基因干扰技术，对可能具有脂酰CoA硫酯酶活性的功能蛋白（Cgl0091,Cgl1664和Cgl2451）进行了鉴定，确定其功能，并采用回补过表达验证了功能蛋白对脂肪酸合成量和组成均有影响。通过开展底物特异性研究，分析不同基因差异性对脂酰CoA硫酯酶活性、脂肪酸合成能力的影响，系统分析了脂肪酸产量、分布类型、碳链数量及饱和度等参数，解析了谷氨酸棒杆菌中脂酰CoA硫酯酶催化规律。通过引入来源于大肠杆菌的fadB基因及对反β氧化相关酶基因进行组合与重排，构建反β氧化模块组件，优化该途径性能与效率。检测胞内ATP水平的变化，分析了能量对脂肪酸合成的影响。本项目的研究成果为构建高效合成脂肪酸的基因工程菌株提供了坚实的理论依据。