犏牛和牦牛A型精原细胞差异表达关键基因的功能分析

Exploring the transcriptional regulating mechanism of spermatogonia differentiation of cattleyak is of paramount scientific significance to clarify the mechanisms of cattleyak spermatogenic arrest. Using cattleyak as the experimental animal, the objectives of this project are to identify and screen the key transcriptional regulation genes related with spermatogenesis after transcriptome sequence analysis from type A spermatogonia of cattleyak and yak; Through the isolation and purification of type A spermatogonia of cattleyak in vitro, overexpression, CRISPR-CAS9 genome editing, and transgenic mouse model will be used to verify the function of transcription factors and analyze the signaling pathways, meantime, combing with CHIP-seq, EMSA, and site-specific mutagenesis, promoter and other transcriptional regulatory elements of key target genes will be identified for the function analysis and validation. The comprehensive function analyses of key genes in the transcriptional regulation of spermatogonia differentiation of cattleyak will be performed to establish transcriptional regulation pathways network, which will provide theoretical and experimental evidences for further studies on molecular mechanism of spermatogonia differentiation and overcome the male infertility of cattleyak.

精原细胞分化的调控机理研究对探讨犏牛精子发生阻滞的机制具有重要科学意义。本课题以犏牛为研究对象，拟在分离高纯度A型精原细胞的基础上，通过犏牛与牦牛A型精原细胞的转录组学分析，筛选与精原细胞分化转录调控相关的关键基因。利用超表达、CRISPR-CAS9敲除技术以及转基因小鼠模型等分别对关键转录基因进行功能验证和信号通路分析，同时结合CHIP-seq技术、EMSA以及定点突变技术对重要靶基因的启动子等调控元件进行筛选鉴定和功能验证；综合分析犏牛精原细胞分化转录调控关键基因功能，构建转录调控通路网络，为犏牛精原细胞分化机理和和雄性不育的克服提供理论和实验依据。

通过对分离获得的A型精原细胞和粗线期初级精母细胞转录组深度测序并以牦牛的相应细胞为对照，从犏牛A型精原细胞和粗线期初级精母细胞中筛选到2960个差异表达基因，其中679个上调表达而2281个基因下调表达。通过GO富集发现有许多差异表达基因与犏牛精子发生阻滞有关系，其中STRA8 和 NLRP14基因的上调可能分别与犏牛睾丸中未分化精原细胞的累积和严重的细胞凋亡有关系；而SPP1, SPIN2B和PIWIL1基因的下调可能影响生精细胞周期以及精原细胞基因组的完整性（图4），与减数分裂过程密切相关的CDKN2C, CYP26A1, OVOL1, GGN, MAK, INSL6, RNF212, TSSK1B, TSSK2和TSSK6基因均在犏牛A型精原细胞和粗线期初级精母细胞中下调表达，另外还有几十个与精子结构组分有关的基因也在犏牛下调表达。Pathway富集后按照富集程度显著性排名前三位的通路中均包含有Wnt/b-catenin pathway, 且其中Wnt3a, PP2A和 TCF/LEF-1基因表达的下调可能导致了犏牛精原细胞分化的阻滞。揭示了犏牛精子发生阻滞可能始于精原干细胞分化阶段，筛选出精原细胞分化为初级精母细胞过程中与犏牛精子发生相关mRNA，并揭示了其在不同牛种睾丸组织生精细胞的表达变化规律，分析犏牛精原细胞分化的转录调控的时空模式规律，筛选出参与调控的关键基因并进行转录调控功能研究。利用超表达、CRISPR-CAS9敲除技术以及转基因小鼠模型等分别对关键转录基因进行功能验证和信号通路分析，同时结合CHIP-seq技术、EMSA以及定点突变技术对重要靶基因的启动子等调控元件进行筛选鉴定和功能验证；综合分析犏牛精原细胞分化转录调控关键基因功能，构建转录调.控通路网络，揭示这些关键基因单独或协同调控犏牛精原细胞分化的内在机理，为犏牛精子发生阻滞机制的解析提供新的理论依据，并将为犏牛雄性不育的克服展现新思路和方法。