非编码RNA-LINC01554在肝癌发生中的作用和分子机制研究

Previously, non-coding RNA-LINC01554 was screened and identified through deep-sequencing paired hepatocellular carcinoma (HCC) tissues and corresponding non-tumor tissues. Our results demonstrated that LINC01554 was down-regulated in 74.25% HCC tumor tissues compared with non-tumor tissues. The down-regulation is correlated significantly with poor overall survival of HCC patients. The in situ hybridization results demonstrated that LINC01554 located mainly in cytoplasm. With the help of software catRapid, the LINC01554 was predicted to bind G3BP2 or EIF5A2. In this study, 1. Further functional studies will be performed to verify the effect of LINC01554 on cell proliferation, migration and invasion. 2. To verify whether LINC01554 interacts with cytoplasmic binding protein G3BP2, interfering with Twist1-G3BP2 binding, and finally inhibiting epithelial-mesenchymal (EMT). 3. To verify whether LINC01554 interacts with EIF5A2 and interfering with its effect on cell growth and metastasis. 4. To perform the correlation analysis of LINC01554, G3BP2 and EIF5A2 in clinical HCC samples. And also, with the help of RNA pull-down assay and mass-spec analysis, 5. to find other candidate proteins which can interact with LINC01554.

前期我们通过对肝癌和癌旁组织测序筛选获得非编码RNA- LINC01554。我们发现LINC01554在74.25%肝癌组织中下调，且下调与患者不良预后显著相关。预实验结果显示LINC01554显著抑制细胞增殖和侵袭能力。细胞和组织原位杂交实验表明LINC01554主要位于胞浆中。软件预测G3BP2和EIF5A2可能与其互相作用。本研究将：1）完善功能实验，探索LINC01554对肝癌细胞生长和转移作用；2）验证LINC01554能否与胞浆结合蛋白G3BP2相互作用，干扰TWIST1与G3BP2促解离，抑制EMT发生；3）验证LINC01554能否与EIF5A2相互作用，干扰其对肿瘤生长和转移的作用；4）进行LINC01554与G3BP2、EIF5A2在临床标本中关联分析和临床意义分析。此外，通过RNA pull-down结合质谱分析，5）寻找其他可能与LINC01554相互作用蛋白。

肝细胞肝癌（HCC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，预后很差。我国肝细胞肝癌的发病率和死亡率在肿瘤中分列第三位和第二位。肝癌被发现时往往已是病程晚期，治疗手段有限，效果却欠佳。阐明肝癌的发病机理能更好地帮助我们在肝癌的诊治上取得突破性进展。. 前期研究中我们通过对肝癌和癌旁非肿瘤组织深度测序筛选获得非编码RNA- LINC01554。我们发现LINC01554在超过70%的肝癌组织中下调，并且LINC01554在HCC患者中的表达水平与临近器官浸润、肿瘤大小及肿瘤分期有显著的相关性。多因素回归分析结果显示LINC01554下调是影响患者预后的独立因素。RNA-FISH结果显示LINC01554主要定位于胞浆中。通过大数据挖掘，我们发现LINC01554不仅在肝癌中呈现低表达，在胆管癌、睾丸母细胞肿瘤、皮肤上皮黑色素瘤和卵巢癌组织中的表达也均呈现下调趋势。细胞功能实验显示LINC01554能够显著抑制肝癌细胞的增殖。当采用CRISPR/Cas9技术敲除LINC01554后，其抑制作用明显消失。采用RNA Pull-down 技术和RNA 免疫共沉淀技术发现LINC01554与G3BP2存在相互作用，未检测到与EIF5A2相互作用。采用RNA pulldown技术将LINC01554结合的蛋白pull down下来送质谱检测。对质谱结果进行验证发现LINC01554能结合PKM2，并且二者存在负向调控关系。进一步实验结果证明LINC01554加速PKM2的泛素化降解并最终影响肝癌细胞的糖酵解水平。过表达LINC01554后PKM2蛋白降解加快；敲低LINC01554后，PKM2降解减慢。当过表达LINC01554时葡萄糖摄取减少，乳酸产量下降。. 研究结果表明LINC01554在HCC患者中的表达水平与临近器官浸润、肿瘤大小及肿瘤分期有显著的相关性。LINC01554下调是影响患者预后的独立因素，有可能为肝癌患者提供预后诊断的标志物，并且揭示了LINC01554抑制肝癌细胞生长的分子机制。