纤毛杆影响嵌合型腺病毒感染T淋巴细胞效率的机制研究

The fiber-shaft of Ad35 was used by researchers in the construction of chimeric adenovirus Ad5F35(containing both the natural short-shaft of Ad35 and the Ad35 knob, Ad5F35S). To investigate the effect of fiber -shaft on infection efficiency of chimeric adenovirus in T lymphocytes, the chimeric adenovirus Ad5F35L (containing both the natural long-shaft of Ad5 and the Ad35 knob) had been generated in our previous research. And obviously higher infection rates were observed by using Ad5F35L compared with the Ad5. With the MOIs increasing, the Ad5F35L vector exhibited a higher infection efficiency in both CD8+/CD4+ T lymphocytes and stimulated CD8+/CD4+ T lymphocytes than the Ad5F35S. In the present study, we will further analysis procedures from 3 aspects including binding to receptors in the cell surface, endocytosis and lysis of the endosomal membrane. The study on the influence of fiber-shaft in infection efficiency and its mechanism will provide a foundation for the development of clinical adenoviral vector.

目前国内外构建的嵌合型腺病毒Ad5F35，其纤毛均使用Ad35的纤毛杆，即Ad5F35S。为了研究纤毛杆对嵌合型腺病毒感染T淋巴细胞效率的影响，本课题组已经成功构建一种新型嵌合型腺病毒Ad5F35L，其纤毛使用Ad5的纤毛杆。前期工作发现，Ad5F35L感染T细胞的效率较Ad5均大幅提高，随着病毒感染复数（multiplicity of infection，MOI）的增加，Ad5F35L对CD8+ T/CD4+ T细胞及刺激活化后CD8+ T/CD4+ T细胞的感染效率均高于Ad5F35S。本课题从病毒与细胞结合、病毒经胞吞入胞、病毒裂解胞内体三方面着手，逐层分析从病毒纤毛结合细胞直至纤毛从病毒粒子脱落的整个过程，对纤毛杆影响Ad5F35感染效率的机制进行深入探讨，为临床用途的病毒载体研发提供参考。

本研究探索并建立了一种分析腺病毒诱导胞内体膜裂解的方法，因目前主要通过sarcin assay来分析病毒裂解胞内体的情况，此方法存在同位素使用的安全性、复杂性，不适合在普通的实验室开展，本研究建立了一种基于荧光染料的简单可行的非同位素分析法。. 接下来研究发现纤毛杆影响Ad5F35感染T细胞效率主要来自两个方面：病毒诱导胞内体膜裂解、病毒进入细胞后的逆向运输。对于Ad5F35L和Ad5F35S而言，与T细胞结合的病毒数量没有差别，经胞吞进入细胞的病毒数也没有差别，或者说相同的病毒结合细胞后，相同数量的病毒经胞吞进入到细胞内；进入到细胞后，Ad5F35L裂解胞内体的能力强于Ad5F35S，更多的Ad5F35L病毒进入到细胞质，而更多Ad5F35S病毒粒子可能停留在溶酶体中，甚至被溶酶体降解，这就导致进入到细胞质的两种病毒粒子发生了差别，进入到细胞质的Ad5F35L粒子较Ad5F35S更多；另外，病毒进入到细胞质后，Ad5F35L、Ad5F35S均有部分病毒并未朝着细胞核运输，而是可能通过囊泡运输至细胞膜并胞吐至胞外，我们的实验表明，病毒感染后6 h，胞吐至胞外的Ad5F35S病毒数更多，进入细胞核的Ad5F35S病毒数进一步减少，因此导致了Ad5F35S、Ad5F35L感染T细胞效率的差别。. 另外我们对T细胞生理状态影响嵌合腺病毒感染效率机制进行初步研究，以血清饥饿处理诱导T细胞生理状态改变，在体外成功模拟了病毒膜受体表达不变而病毒感染效率明显改变的现象，并以此为基础从病毒结合、进入、逃脱等方面分析了影响Ad5F35感染效率的原因，结果表明其会导致病毒进入和病毒逃脱的过程发生明显改变。本研究丰富了有关嵌合型腺病毒感染靶细胞的机制研究，也为日后临床上高效、安全腺病毒载体开发提供理论支持。