蛋白质亚硝基化对牛肉成熟嫩化过程中细胞凋亡的调控机理研究

Meat tenderness has been the critical issue for the consumer and meat industry in China. Caspases and its interaction with calpains play a key role in myofibrillar protein degradation during postmortem aging and meat tenderization in beef. Nitric oxide (NO) is produced by nitric oxide synthase (NOS) and modifies the protein cysteine to form protein S-nitrosylation (SNO). Protein S-nitrosylation could change protein structure and function which potentially contributes to the regulation of beef meat quality. Based on results in our previous studies, this project is to investigate the effect of protein S-nitrosylation on muscular cell apoptosis during postmortem aging in beef, in particular via the regulation of mitochondrial pathway. The critical S-nitrosylated cysteines of caspases that are responsible for the change of SNO-caspases activity and proteolysis of myofibrillar proteins would be quantitatively identified by using immunomics, proteomics and other technologies. This study would give a better understanding about how NO and protein S-nitrosylation regulate the beef meat quality, especially the meat tenderness. Meanwhile, the result would further enrich and develop the basic mechanism for elucidating the biochemical and physiological changes in beef muscle cell during postmortem aging.

牛肉的嫩度一直是我国消费者和肉类企业关注的热点问题。细胞凋亡酶系统介导的与钙激活酶相互作用对宰后肌原纤维蛋白的降解是宰后牛肉成熟嫩化的关键影响因素。宰后牛肉成熟期间，一氧化氮合成酶催化产生的一氧化氮对蛋白质的半胱氨酸巯基进行修饰导致蛋白质亚硝基化，从而改变蛋白质的结构与功能，在宰后牛肉品质的调控中扮演重要角色。基于前期研究成果，本项目主要研究蛋白质亚硝基化对牛肉成熟过程中细胞凋亡的影响，特别是对细胞凋亡线粒体途径的调控作用，使用免疫组学、蛋白质组学等技术定性定量分析牛肉成熟过程中细胞凋亡酶关键位点修饰，及亚硝基化对细胞凋亡酶活性和降解肌原纤维蛋白能力的作用机制，为阐释一氧化氮和蛋白质亚硝基化调控宰后牛肉成熟过程中品质的形成，尤其是嫩度的改善提供理论依据，为深入阐述牛肉成熟过程中肌细胞生理生化变化及丰富和发展宰后牛肉的成熟机理奠定基础。

牛肉的嫩度一直是我国消费者和肉类企业关注的热点问题。宰后牛肉成熟期间，一氧化氮对蛋白质的半胱氨酸巯基进行修饰导致蛋白质亚硝基化，从而改变蛋白质的结构与功能，但亚硝基化对肌细胞凋亡的影响还是未知。因此，本项目旨在探究蛋白质亚硝基化对牛肉成熟过程中细胞凋亡的调控机理，为阐释蛋白质亚硝基化调控牛肉品质的形成及嫩度的改善提供依据。主要创新性结果如下：.1. 通过NOS抑制剂和NO供体对牛肉半膜肌进行处理发现，NOS抑制剂处理可以降低牛肉的pH值和持水力，提高牛肉嫩度和亮度值。此外，细胞形态学观察结合原位末端法结果表明，蛋白质亚硝基化能够抑制宰后成熟过程中牛半膜肌细胞凋亡的进程。.2. 体外设置不同浓度的NO供体诱导细胞凋亡酶3发生亚硝基化，结果表明，NO能够通过亚硝基化修饰细胞凋亡酶3从而抑制其活性。质谱分析结果显示，细胞凋亡酶3共有5个亚硝基化修饰位点，分别位于Cys 116、170、184、220和264。此外，亚硝基化的细胞凋亡酶3显著抑制了肌间线蛋白和肌钙蛋白-T的降解。.3. 蛋白质亚硝基化可以促进抗凋亡蛋白Bcl-2的表达，延缓线粒体膜电位的下降，同时抑制细胞色素c从线粒体向细胞质的易位，同时下调细胞凋亡酶9和3的级联反应，进而延缓了牛肉半膜肌细胞凋亡进程。以上表明，蛋白质亚硝基化能够通过内在线粒体凋亡途径调控牛肉成熟过程中肌细胞凋亡过程。.4. 鉴定不同外源处理的牛肉半膜肌中的差异性亚硝基化蛋白，主要有钙离子释放调节蛋白、能量代谢酶、细胞色素b-c1复合物等，提示蛋白质亚硝基化引起宰后牛肉肌细胞重要生化代谢途径水平不同，进而导致了牛肉品质的差异。此外，通过研究亚硝基化与细胞凋亡及牛肉品质的相关性，得出蛋白质亚硝基化通过调控肌细胞凋亡进程影响牛肉品质的形成。.本项目研究结果表明牛肉成熟过程中，一氧化氮对肌细胞蛋白质的亚硝基化修饰可以通过线粒体凋亡途径，影响细胞凋亡酶的活性和细胞凋亡的发生，进而调控牛肉成熟过程中肌原纤维蛋白的降解和肉品质的形成。