梭链孢烷抗生素的生物合成机制及其组合生物合成研究

Fusidane-type antibiotics represented by fusidic acid, helvolic acid and cephalosporin P1 are an unique class of fungi-derived triterpenoids with potent anti-bacterial activity, of which, fusidic acid has been clinically used. We have previously revealed the complete biosynthetic pathway of helvolic acid using Aspergillus oryzae expression system. Based on this knowledge, we found the potential biosynthetic gene clusters of fusidic acid and cephalosporin P1 by homology analysis, both containing six genes coding proteins highly homologous to the six enzymes involved in the early-stage biosynthesis of helvolic acid. We thus hypothesized that the six-gene catalyzed pathway is shared by all the fusidane-type antibiotic, which then branches to form different fusidane-type antibiotics under the action of the respective post modification enzymes with good substrate versatility. In this study, we first elucidate the biosynthetic mechanism of fusidic acid and cephalosporin P1 by one-step or step-by-step introduction of the post modification genes into six-gene expressing strain. Then, we will rationally combine all the post modification genes from the biosynthesis of fusidane-type antibiotics and introduce them into the six-gene expressing strain to generate various fusidane-type derivatives. This project will not only systematically reveal the biosynthetic mechanism of fusidane-type antibiotics, but also be expected to obtain more active fusidane-type derivatives by combinatorial biosynthesis.

以夫西地酸、烟曲霉酸和头孢菌素P1为代表的梭链孢烷抗生素是一类生源特殊且具重要抗菌活性的真菌三萜化合物，其中夫西地酸已作为临床药物使用。前期我们利用米曲霉表达体系，首次揭示了烟曲霉酸的生物合成途径，并通过同源分析找到了夫西地酸和头孢菌素P1潜在的生物合成基因簇，结果发现二者均含有负责烟曲霉酸早期生物合成的六个保守基因。基于此，我们推断梭链孢烷抗生素的生物合成早期均由保守的六基因完成，然后发生分支，在各自后修饰酶的作用下生成不同的抗生素，且后修饰酶多具有良好的底物宽泛性。本项目拟在已构建的六基因表达菌株的基础上，通过一次性或逐步导入夫西地酸或头孢菌素P1的后修饰基因，阐明二者的生物合成机制，并对梭链孢烷抗生素的所有后修饰基因进行理性组合，并导入到六基因菌株中，以制备结构多样的梭链孢烷衍生物。本项目不仅将系统揭示梭链孢烷抗生素的生物代谢网络，还有望利用组合生物合成获得活性更优的梭链孢烷衍生物。

以夫西地酸、烟曲霉酸和头孢菌素P1为代表的梭链孢烷抗生素是一类结构特殊的真菌三萜抗生素，具有突出的抗革兰氏阳性菌活性，其中夫西地酸已作为临床抗菌药物被广泛使用。梭链孢烷抗生素抑菌机制独特，是目前临床使用的抗生素中唯一作用于核糖体移位因子EF-G的抗生素，与其它临床常用抗生素无交叉耐药性。因此，在抗生素耐药性问题越来越严重的当下，获得活性更强，应用范围更广的梭链孢烷衍生物具有重要意义。迄今为止，研究人员利用化学衍生化以及生物转化等方法对夫西地酸的结构进行了大量改造，但至今仍未获得比夫西地酸活性更强的衍生物。组合生物合成已成为丰富天然产物结构多样性的有力手段，但其成功运用的前提需要揭示目标化合物的生物合成途径以及生物合成酶的底物宽泛性。. 本项目在前期阐明烟曲霉酸生物合成途径的基础上，通过米曲霉异源表达，体外酶催化以及底物喂养等实验，系统地阐明了夫西地酸与头孢菌素P1的生物合成途径。我们证明了梭链孢烷抗生素的生物合成早期均由保守的六个酶催化完成，然后发生分支，在各自后修饰酶的作用下生成不同的化合物，且后修饰酶多具有良好的底物宽泛性。基于此，我们构建了一种“基于共有中间体的后修饰基因随机组合生物合成”策略，将所有的后修饰酶基因进行随机组合，然后导入到含有保守六基因的米曲霉转染菌株中，最大限度的拓展了梭链孢烷抗生素的结构多样性。最终，在设计的27种基因组合中，24种发挥了作用，共分离鉴定了58个产物，包括54个新化合物。基于大量获得的梭链孢烷类衍生物，我们系统研究了其抗金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌的活性，并揭示了新的构效关系。本项目不仅首次系统揭示了梭链孢烷抗生素的生物合成网络，而且构建了“基于共有中间体的后修饰基因随机组合生物合成策略”，极大地丰富了梭链孢烷抗生素的结构多样性，并从中发现了具有成药前景的候选分子，为梭链孢抗生素的开发奠定了物质基础。