特异性DNA探针和特征肽指纹图谱技术在燕窝质量评价中的应用

燕窝属于进口昂贵珍稀之物，目前市场上品种多、质量参差不齐，同时缺乏科学的质量评价标准。本课题是在国家自然科学基金面上项目《电泳和mtDNA技术在燕窝鉴别中的应用》研究基础上的后续研究；结果证明所采用的DNA分析方法可克服燕窝样品中DNA质量欠佳和外源性污染严重的干扰，准确鉴定燕窝的基原。故本课题在DNA多态性分析基础上扩大燕窝样品的品种、收集产地，增加检测的信息位点以获得更确切的燕窝种间及种群的遗传关系，筛选正品燕窝特异性DNA序列并制备特异性引物和探针以建立一种商品燕窝探针杂交检测方法；同时研究结果证明正品燕窝存在特征性的蛋白条带，故采用胰蛋白酶切法对收集的燕窝样品及伪品进行预处理并采用反相高效液相色谱法对其进行指纹图谱研究，使用相似度评价软件建立共有模式，比较不同品种、产地、加工工艺之间的相似度，建立燕窝特征肽指纹图谱，为燕窝建立一套科学有效的质量评价方法打下基础。

燕窝属于进口昂贵珍稀之物，目前市场上品种多、质量参差不齐，同时缺乏科学的质量评价标准。本课题收集来自马来西亚、印尼、泰国、越南等不同国家的不同品种的真伪品燕窝（马来西亚白燕盏、马来西亚洞燕、印尼白燕盏、印尼血燕盏、印尼龙牙盏、泰国白燕盏一期、泰国白燕盏二期、泰国白燕盏三期、越南洞燕等）约65种。通过进行实地考察和采集不同地理居群的燕窝样品，对其来源和品种进行鉴定分类。对所采集燕窝样品进行质量标准检测，通过对燕窝样品的各项指标（蛋白质、氨基酸构成、多糖、水解单糖构成、唾液酸、无机元素等）进行含量检测，进一步完善燕窝质量标准规范，为燕窝的质量标准控制体系建立基础。 .对实地采集未进行任何加工的燕窝样品分别针对ND2、COI、12S rRNA基因序列片段进行PCR扩增，利用相似性搜索法（BLAST）、最近距离法（nearest distance）等对燕窝的物种进行鉴定分析。利用软件MEGA6.0中的ClustalW对样品序列进行比对，分析变异位点；利用Kimura 2-parameter model计算遗传距离，构建Neighbor-joining系统发育树，利用Boostrap(1000次重复)检验各分支的支持率；最终建立燕窝商品基原物种的Cytb、ND2、COI、12S rRNA条形码序列。.通过荧光定量PCR对燕窝样品进行检测，对雨燕属、金丝燕属和其他物种细胞色素b基因的序列进行分析。设计一条特异靶向雨燕属和金丝燕属细胞色素b基因的TaqMan探针，发现此探针具有良好的特异性和灵敏度，可检测痕量的燕窝样品，但对于其他物种检测结果为阴性。所设计的TaqMan探针和实时荧光PCR方法可应用于燕窝的真伪鉴别，准确性高、实用性强。.利用非标记定量法对燕窝中蛋白质进行定量分析，比较不同基因型燕窝的蛋白质含量差异。四种不同基因型燕窝的水溶性蛋白差异比较发现不同基因型燕窝蛋白存在明显差异，其中四种不同基因型燕窝中共有蛋白可作为燕窝产品的质量控制特征，促进燕窝质量标准建立。.利用仿人体胃液消化(SGF)技术及 HPLC 技术建立燕窝多肽图谱，利用仿人体胃液消化(SGF)技术能有规律地可把燕窝中的蛋白质分割成多肽分子。再从 HPLC 中分离个别多肽并进行纯化，利用 LC-MS/MS 系统来辨识多肽并建立燕窝专属的多肽图谱，该图谱可作为建立燕窝蛋白组学的基石。