骨髓间充质干细胞作为免疫调节基因载体内耳局部治疗自身免疫性梅尼埃病的实验研究

本项目基于现有的研究基础和发现，即：⑴同种纯化内耳抗原(PIEAg)免疫豚鼠,造成自身免疫性梅尼埃病(AIMD)动物模型,并已获得抗PIEAg单克隆抗体；⑵免疫调节基因(IL-10,IL-4,Fasl基因）导入自身免疫性内耳病模型动物的内耳局部，显示出良好治疗效果(内耳功能损伤和组织病理损伤减轻)，导入的基因及其产物在内耳呈较为规则的分布和表达。此次拟采用PIEAg免疫豚鼠，制备AIMD动物模型。选择不同的免疫调节基因分别与病毒类和非病毒类载体构建重组载体，体外感/转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)。并将重组载体偶联抗PIEAg单克隆抗体，经不同途径将BMSCs和偶联单抗的载体导入AIMD模型动物内耳，观察内耳的生理功能、病理形态学和免疫组织化学变化，并行Western blot和RT-PCR试验等指标的观察分析，了解治疗效果，探索较好的治疗途径和方法，为今后的临床应用提供依据和参考。

完成的主要研究内容和结果有：（1）纯化内耳抗原制取和自身免疫性内耳病（AIED）（包括自身免疫性感音神经性聋(ASNHL)和自身免疫性梅尼埃（AIMD））动物模型制做：采用豚鼠内耳组织，经非变性凝胶电泳技术，分离、纯化出58KD成份，用其免疫豚鼠（包括内淋巴囊局部免疫），成功造成AIED动物模型。（2）重组基因载体制备和内耳局部导入治疗自身免疫性内耳病：分别采用白细胞介素10（IL-10）基因、白细胞介素4(IL-4)基因和FasL基因与腺病毒或慢病毒构建重组载体，分别经圆窗膜渗透、鼓阶内注射和内淋巴囊局部注射的途径，导入内耳，经内耳生理功能、病理形态学观察及其免疫组化试验等，证实具有良好的治疗效果。（3）IL-4或IL-10重组慢病毒载体修饰间充质干细胞（包括骨髓间充质干细胞（BMSCs）和脂肪间充质干细胞（ADMSCs））构建和内耳局部植入治疗自身免疫性或免疫性内耳病：分别采集豚鼠BMSCs和ADMSCs，培养和传代后，感染IL-4或IL-10重组慢病毒载体。再分别经鼓阶途径植入免疫性内耳病或自身免疫性内耳病动物内耳，经内耳生理功能、病理形态学观察及其免疫组化试验等，证实具有良好的治疗效果。（4）抗波形蛋白单克隆抗体制取及其偶联重组基因载体内耳局部导入治疗自身免疫性内耳病：经豚鼠自身免疫性梅尼埃病相关抗原相对分子质量68000蛋白的二维电泳和质谱分析，证实波形蛋白极可能是主要致病蛋白抗体成分。采用噬菌体展示技术制取抗波形蛋白单克隆抗体，与IL-10重组慢病毒载体偶联，导入AIED模型动物内耳（鼓阶），显示具有良好的治疗效果。（5）其他：利用本项目经费，还进一步开展了豚鼠自身免疫性梅尼埃病相关抗原相对分子质量68000蛋白的二维电泳和质谱分析研究，并证实了其致病性及其主要成分极可能为波形蛋白；鼓室内应用甲基泼尼松龙和庆大霉素治疗自身免疫性膜迷路积水临床研究，证实具有良好的治疗效果；免疫性内耳病模型的建立及其内耳干扰素-γ 的表达实验研究证实，干扰素-γ在内耳免疫炎性损伤中有极其重要的作用。