miRNA-501和let-7a促进HBV复制的机制研究

乙肝病毒（HBV）相关性疾病严重威胁国人的健康，现有治疗方法尚无法完全清除体内的乙肝病毒。microRNA(miRNA)是一类广泛存在于生物体内的小RNA，在转录后水平调控基因的表达, 参与人体多种重要生理、病理过程。本课题组利用miRNA表达谱芯片发现 miR-501和let-7a在HBV稳定复制细胞系的表达上调，且在体外证实它们的抑制物可显著抑制HBV复制。本项目拟通过1.组织标本进一步确定miR-501和let-7a表达水平与HBV复制状态的关系；2.报告基因实验和Western blot等技术验证miR-501和let-7a对假定靶基因的调控作用，并探讨可能的下游通路；3.构建慢病毒介导的miRNA抑制性表达载体,观察miR-501和let-7a作为分子靶点用于抑制体内HBV复制的作用。本项目将从全新角度探讨HBV复制的分子机制, 进而为抗HBV治疗提供新思路和途径。

我们前期通过miRNA芯片筛选和qRT-PCR验证发现，miR-501和let-7a在HepG2.2.15中的表达水平显著高于HepG2。本课题旨在探讨miR-501和let-7a对HBV复制的影响及其机制。取得的研究结果有：1.将miRNA的特异性抑制剂转染入HepG2.2.15中，qPCR和ELISA检测显示，miR-501和let-7a 的抑制剂能显著降低HBV DNA、mRNA 和蛋白水平，并且具有时间依赖性；2. 生物信息学预测的众多 miR-501 的靶基因中包括已明确的HBV复制抑制分子 HBXIP，而 let-7a 的预测靶基因中包括HBV mRNA 序列和已明确的HBV复制相关分子Ras；3. miR-501 特异性抑制剂显著增高了HBXIP蛋白在HepG2.2.15细胞中的表达水平，但不影响其mRNA 水平；miR-501 通过结合克隆于荧光素酶基因编码区下游的HBXIP 3’UTR 的靶位点，抑制荧光素酶表达；4. HBXIP siRNA 能有效抑制HBXIP 蛋白的表达，并能逆转 miR-501抑制剂对HBV复制的抑制效果； 5. 根据计算机预测，let-7a 可能直接作用于HBV mRNA 序列，将let-7a 的潜在作用靶点克隆入报告基因载体，双荧光素报告基因结果表明，let-7a 不能直接作用于HBV mRNA 序列；与对照细胞相比，转染 let-7a反义抑制物的 HepG2 细胞的 K-Ras 蛋白水平明显升高，而 mRNA 水平则无显著差异；let-7a 通过结合克隆于荧光素酶基因编码区下游的 K-Ras 3’UTR的靶位点，抑制荧光素酶表达；6. let-7a 的抑制剂有效抑制HBV核心启动子和增强子的活性，发挥类似 Ras 通路的功能；负显性突变的 Ras 能逆转 let-7a的抑制剂对HBV复制的抑制作用；7. 新鲜临床标本检测表明，let-7a 和 miR-501 在HBV高复制肝组织中的表达水平明显高于HBV低复制肝组织。上述结果提示，miR-501和let-7a分别通过负性调控HBXIP和Ras而促进HBV复制。