杂合病毒介导hKGF基因防治小型猪腮腺放射损伤研究

Radiation-induced salivary gland dysfunction in patients with head and neck cancer is a common complication of radiotherapy, usually leading to a series of symptoms, such as dry mouth, oral infections, mucositis and so on, with severe impact in patient's quality of life. Up to date, there is no an effective treatment or prevention for radiation-induced salivary gland hypofunction. Our previous studies successfully used a large animal, miniature pigs to establish a radiation damage model for salivary gland hypofuction and used this model to treat the salivary gland hypofunction by delivering AdhAQP1 and AAV2-hAQP1 into parotid glands. Currently, we raised a question: can we prevent the radiation-induced salivary hypofuction because prevention will be the best way in the treatment of radiation-induced salivary hypofuction? A recent study showed that keratinocyte growth factor (KGF) can prevent of the radiation-induced salivary gland hypofunction in mice. Therefore, it is very important to test this in the large animal model in order to apply the KGF in clinical practices. In this study, a hybrid serotype 5 adenoviral vector encoding hKGF (AdLTR2EF1α-hKGF), which vector has potential for long term expression, will be used. First, the prevention function of the KGF will be investigated in the mini-pigs. Next, we will explore mechanism of the KGF for the prevention of radiation-induced damage, like effects on progenitor cells/stem cells or microvessel. We hypothesize that the KGF gene therapy can prevent the radiation-induced salivary gland dysfunction in the large animal model, and provide the key pre-clinic data for the future clinical trial and application in the prevention of the radiation-induced salivary gland hypofunction.

涎腺放射损伤是头颈部恶性肿瘤放射治疗常见并发症，可引起口腔干燥、粘膜炎等一系列症状，严重影响患者生活质量，尚无有效防治方法。本课题组成功建立了小型猪腮腺放射损伤模型，并通过Ad-hAQP1和AAV2-hAQP1的基因系列治疗在一定程度上修复小型猪腮腺唾液流率。但我们认为：预防涎腺放射损伤的发生是最好的方法。研究显示：角质细胞生长因子(KGF)可以有效预防小鼠涎腺放射损伤的发生；杂合病毒载体可使目的基因长期稳定表达。因此，本研究旨在研究杂合病毒载体介导hKGF基因预防小型猪腮腺放射损伤的效果，检测hKGF表达情况与腮腺前体/干细胞数量或微血管密度；并通过研究KGF对于上皮 细胞/内皮细胞的影响，分析KGF的作用机理。通过本研究有望获得KGF基因治疗预防涎腺放射损伤的大型动物实验数据，为临床应用搭建桥梁，为涎腺放射损伤这一难治性疾病提供一个有效的防治方法。

唾液腺放射损伤是头颈部恶性肿瘤放射治疗的常见并发症，引起唾液量显著下降造成口腔干燥、放射性龋等系列症状，严重影响患者的生活，目前尚缺乏有效的治疗手段。原有的基础研究多使用啮齿类动物模型，小型动物实验结论转化到临床应用需要大型动物实验的论证。课题组曾建立小型猪腮腺单次放疗损伤模型，由于其放疗方式与临床采用的分割放疗差异过大，所以课题组建立了小型猪腮腺分割放射损伤模型，使其放射方案更加贴近临床，为基础研究的临床转化提供一个新的桥梁。角质细胞生长因子KGF又称FGF7，是纤维细胞生长因子家族FGFs成员，它对促进细胞生长、分化、增殖具有重要作用，对上皮细胞的促有丝分裂作用是FGF2的2~10倍。前期研究提示KGF及FGF2可以预防小鼠涎腺放射损伤。本研究在小型猪这一大动物模型上，采用杂合病毒载体研究其对于唾液腺放射损伤的防护影响。由于放射设备更新的原因延误了实验计划，至目前课题组进行了小型猪腮腺分割放射损伤模型的建立、AdLTR2EF1a-FGF2预防小型猪腮腺放射损伤的实验以及AdLTR2EF1a-KGF对于小型猪腮腺转导剂量的筛选。在小型猪腮腺7.5Gy×5分割放射损伤模型建立中，我们发现放射靶区的组织反应较单次20Gy放疗反应明显减轻，且唾液流率下降更加稳定，经过连续5天的全麻对于小型猪来说也是安全的。前期研究提示放射损伤可能早期损伤腺体的血管内皮细胞，本研究通过多普勒血流仪直接测定受放射腺体的血流率，发现其局部血流下降明显早于唾液流率的下降，证明放射损伤对于腺体微血管的影响要先于腺泡细胞。在验证KGF、FGF2对于腺体放射损伤具有防护作用前，先进行了剂量筛选实验。通过Elisa法检测目的基因只表达于小型猪腮腺组织提取物中，且以不同梯度进行基因转导发现1×1011vp 并不能提高转导效果。AdLTR2EF1a-FGF2实验选用了2×1010vp进行小型猪腮腺放射损伤防护的研究。从中发现，实验组腮腺唾液流率及微血管密度均较对照组显著升高，说明FGF2可能是通过保护微血管从而起到放射防护作用。AdLTR2EF1a-KGF的防护实验正在进行中。通过上述研究我们建立了小型猪腮腺分割放射损伤模型，为唾液腺放射损伤研究提供一个更加贴近临床的大动物模型，揭示了纤维细胞生长因子可能通过保护微血管而起到腺体的防护作用，为唾液腺放射损伤防护提供新的依据，并且证明了杂合病毒载体的安全性。