基于CRISPR/Cas9技术靶向突变BnFLCs编码区及其启动子顺式元件E-box创造早熟抗寒甘蓝型油菜的探索研究

Brassica napus L. is a typical winter biennials plant, responses to vernalization and has strong cold-tolerance at vegetative stage. In recent years, as were Yangtze River area, more and more early-maturing rapeseed varieties start to be planted in the winter fallow field of Hunan and Hubei province, since the popularization of yearly ‘early rice-late rice-rapeseed’ or ‘rice-ratoon rice-rapeseed’ cropping system. Unfortunately, the weak cold-tolerance of early-maturing rapeseed varieties rises the risk of freeze injury in cold winter and spring, so it is vital to select early-maturing and cold/freeze resistant Brassica napus varieties. In this project, we will edit the ORF and cis-element E-box of 9 BnFLCs using the CRISPR/Cas9 system to generate early-maturing and cold/freeze resistant Brassica napus mutant lines. The functions of 9 BnFLCs in the rapeseed flowering time, cold-resistance and other agronomic traits will be characterized respectively, the similarities and differences of the 9 BnFLCs will be compared, and the coordination and interaction between the 9 BnFLCs will be evaluated. To further characterize the roles of cis-element E-box in the cold-response and vernalization of rapeseed, the expression patterns of 9 BnFLCs and cold-responsive genes in mutant lines and wild-type plants with or without cold treatments will be analyzed. Implementation of this project will be revealed the functions of BnFLCs in the rapeseed flowering time, cold-resistance and other agronomic traits, as well as to providing fundamental basis and genetic resource for cold-resistant, early-maturing Brassica napus vateries breeding.

油菜是典型的越冬作物，抗寒性较强。为了充分利用长江流域大面积的冬闲田，湖南湖北等地近年来开始推广“稻-稻-油”三熟制栽培模式，种植早熟、特早熟甘蓝型油菜品种，但早熟品种往往抗寒性较弱，而创造和选育耐寒性强的早熟油菜品种可从根本上解决这一矛盾。本项目拟利用CRISPR/Cas9系统对抗寒性强的甘蓝型油菜中的9个BnFLC基因编码区及其启动子E-box（关键抗寒转录因子ICE1直接结合的顺式元件）进行定向编辑，以期筛选出早熟且抗寒性强的突变株系。通过比较分析各突变类型后代，明确9个BnFLC成员各自对甘蓝型油菜花期、抗寒性及其他农艺性状的影响；解析9个BnFLC成员在油菜花期调控中的相互效应，以及FLC介导的花期变化对植株抗寒性及其他农艺性状的影响；阐明E-box在BnFLCs响应低温以及春化应答反应中的功能。本项目的研究结果可为早熟、抗寒甘蓝型油菜分子设计育种提供理论依据和种质资源。

油菜是典型的越冬作物，抗寒性较强。为了充分利用长江流域大面积的冬闲田，湖南湖北等地近年来开始推广“稻-稻-油”三熟制栽培模式，种植早熟、特早熟甘蓝型油菜品种，但早熟品种往往抗寒性较弱，而创造和选育耐寒性强的早熟油菜品种可从根本上解决这一矛盾。本项目利用CRISPR/Cas9系统对抗寒性强的甘蓝型油菜中的9个BnaFLC基因编码区及其启动子E-box（关键抗寒转录因子ICE1直接结合的顺式元件）进行定向编辑，分别获得了20株和10株T0代转化植株，其中BnaFLC基因编码区编辑植株中有2株出现早花表型。自交繁种得到T1代植株，其中BnaFLC基因编辑植株中两个早花株系生长至7-8叶期开始抽薹，平均开花时间（播种到开花）提前到40-45天。二代测序分析发现早花株系#1的绝大多数单株中8个BnaFLC成员（BnaC03.FLC2除外）均被成功编辑；早花株系#2中除BnaC03.FLC2和BnaA03.FLC2外，其余7个BnaFLC成员被成功编辑；其他几个株系中没有或者只有少数BnaFLC成员被编辑，未表现出株系#1和#2的极早花表型。说明甘蓝型油菜BnaFLC成员之间在抑制油菜开花中存在较为明显的功能冗余，只有敲除大部分BnaFLC成员才能出现早花表型。对BnaFLC基因编辑早熟油菜株系T2代及野生型（湘油15号）对照株系5叶期茎尖和顶叶进行转录组测序分析，发现在野生型的茎叶中， BnaA02.FLC的表达量最高，BnaA03.FLC1、BnaA10.FLC、BnaC03.FLC1的表达量次之，BnaA03.FLC2和BnaC09.FLC1略有表达，其余3个BnaFLC基因中几乎无表达；且各基因在茎尖中的表达水平均高于在顶叶中的表达水平。4个高表达的BnaFLC基因的表达水平在两个敲除株系中均不同程度地降低。与之相反的是，相较于对照株系，两个敲除株系中4个BnaSOC1基因的表达量均不同程度地上升。开花信号通路中的其他调控基因（如CO、FT、FD、LFY、AP1、TFL1）的表达量在对照株系和敲除早花株系间均无明显变化，因此我们推测敲除甘蓝型油菜BnaFLC基因，可以提高BnaSOC1基因的表达，从而促进开花。.本项目创造了丰富的早花突变位点，且丰富了我们对甘蓝型油菜开花信号的认识，为早熟甘蓝型油菜分子设计育种提供理论依据和种质资源。