定向纳米纤维诱导神经细胞生长机理的系统生物学研究

本课题的目的是采用系统生物学方法，从基因转录、miRNA调节、蛋白质表达、代谢物变化等层次，全面系统地研究定向聚乳酸纳米纤维诱导神经细胞生长的机理。首先采用静电纺丝法制备纳米纤维；再采用MTT、RT-CES、流式细胞仪与激光共聚焦显微镜等分析纳米纤维粗细、密度、方向性等对纤维上神经细胞活力、突触、粘着斑等的影响，筛选出最佳直径和密度的定向/不定向纳米纤维；接着运用基因芯片、蛋白质组学、miRNA测序、代谢组学等组学技术和生物信息学方法研究定向/不定向纳米纤维与神经细胞不同作用时间的影响；然后在系统生物学整体层面整合各组学的实验数据，找出定向纳米纤维诱导神经细胞生长的信号通路，筛选出相关关键基因、蛋白质、miRNA和代谢物，并进行系列验证实验；最后综合所有实验结果，得出从基因、miRNA、蛋白质到代谢物的自上而下的完整生物学途径，在分子水平上系统全面地解释定向纳米纤维诱导神经细胞生长机理。

定向纳米纤维能模仿细胞外基质和提供适合的接触引导来帮助神经细胞分化及突触生长，但目前其诱导神经细胞分化的内在机制尚未阐明。. 本项目的目的是采用系统生物学方法全面系统地研究PLLA定向纳米纤维诱导PC12细胞分化的机理。首先制备PLLA薄膜、不定向/定向纳米纤维并进行理化性能表征；其次在细胞水平上分析PLLA基底对PC12细胞活力、细胞骨架、葡萄糖、乳酸代谢、细胞形态和神经突触长度的影响；接着分析纳米纤维对神经元分化标志基因GAP43表达的影响；然后运用基因表达谱芯片、蛋白质组学、microRNA测序、代谢组学技术和生物信息学方法研究PLLA不定向/定向纳米纤维对PC12细胞的影响，并进行系列验证实验；随后整合系统生物学各组学实验数据，筛选PLLA定向纳米纤维诱导PC12细胞分化中的关键基因、蛋白质、microRNA、代谢物及共同参加的关键信号通路，系统全面解释定向纳米纤维诱导PC12细胞分化的分子机理；最后还联合采用多种组学技术分析整联蛋白在介导PLLA定向纳米纤维影响PC12细胞分化中的作用。. 本研究发现，相对于PLLA不定向纳米纤维，定向纳米纤维更能提高PC12细胞活力和葡萄糖、乳酸代谢水平，显著上调GAP43基因表达水平，促进突触生长并引导突触沿定向纳米纤维的取向伸展。PLLA定向纳米纤维可能通过吸附蛋白质与PC12细胞整联蛋白发生作用，触发FAK-MEK-ERK信号通路，诱导一系列分化相关基因、蛋白质、microRNA、代谢物发生差异表达，并通过关键的粘着斑通路、MAPK信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节通路、整联蛋白介导的细胞粘附通路、酪氨酸通路、鞘脂类代谢和甘油磷脂代谢通路，促进PC12细胞的分化。而整联蛋白受到GRGDS五肽竞争性干扰后，可影响PC12细胞氨基酸代谢、生物合成、细胞骨架等多个方面的功能，最终抑制PLLA定向纳米纤维上PC12细胞的分化。. 本研究组不但成功地运用系统生物学中的全部生物组学技术，并创新性地探索出各组学大数据的综合分析方法，首次系统地从“基因-microRNA-蛋白质-代谢产物”多层次分子水平上阐明了PLLA定向纳米纤维影响PC12细胞分化的分子机制。该技术路线不但为“生物材料与机体相互作用机理研究”开创了道路，并为探索以机制、定量研究为主的“信息生物学”模式和“系统生物学”联合分析模式打下了基础。