强直性脊柱炎骨化诱导相关因子的基因克隆与鉴定

强直性脊柱炎( ankylosing spondylitis AS)最终病理变化是在以脊柱为主的中轴关节骨化，导致脊柱的骨性强直。前期实验发现：AS患者椎旁纤维母细胞、成骨细胞表达多种成骨因子。利用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization, SSH ）技术比较性的研究AS患者与非AS患者椎旁组织细胞基因表达差异时，克隆到3条AS患者特异性表达基因片段。杂交鉴定显示其中1条仅在AS患者椎旁纤维母细胞中表达，正常组织未见阳性反应。初步断定其为与AS患者椎间骨化诱导相关的表达基因。对该基因的进一步研究有助于从基因水平揭示AS的发病机制，进而为临床治疗寻找新的途径和方法。为此，本项目拟采用RACE、基因测序等方法扩增该基因全长序列，并对其进行结构分析和功能预测，进一步通过基因克隆表达，观察表达产物对纤维母细胞、成骨细胞增殖的影响，探讨新基因的功能。

本研究旨在通过cDNA末端快速补齐技术（RACE）克隆到前期研究发现的差异表达基因片段的基因全长，并探讨其在强直性脊柱炎（AS）骨化过程中的作用。对AS组织的组织病理学检测表明，AS棘上韧带基质破坏、胶原纤维改变、有骨形成趋势；构建AS棘上韧带的5’- RACE ready cDNA文库，采用基于PCR的RACE技术，通过基因特异性巢式引物对S15、S29和S32片段进行克隆，成功获得3条基因的全长序列；进而对其中的S29全长（干扰素调节因子7，IRF-7）、S32全长（转化生长因子-β受体III，TBRIII）以及其它7条基因在AS棘上韧带中的表达进行检测，realtime PCR表明9条基因均在AS棘上韧带中表达显著高于正常对照，进一步的western blot检测也表明其中的6个蛋白，包括IRF-7、TBRIII、转化生长因子β受体I（TBRI）、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属酶3（MMP-3）和骨形成蛋白2（BMP-2），均在AS组织中高表达；IRF-7蛋白原核表达纯化后，其蛋白饲喂对成纤维细胞NIH-3T3的细胞增殖、细胞骨架、矿化均无明显影响，提示其不参与AS病理进程；而在NIH-3T3中过表达TBRIII后，较正常和低表达TBRIII细胞明显促进细胞增殖、膨大和细胞矿化，提示其可能参与了AS病理进程中软组织增生、骨化的过程。本研究为AS发病的分子机制研究提供了一个可能的新致病基因，有望成为AS药物干预的一个候选靶点。本研究圆满完成实验计划，并投送SCI论著2篇，其中接收1篇，另一篇修回中，发表中文核心期刊论著5篇及综述1篇，授权实用新型专利1项，申请发明专利1项。