人肝细胞三维共培养对细胞色素P450酶和转运蛋白表达调控的影响及机制研究

人源性肝细胞是对候选化合物的体外ADME性质进行准确评价的重要模型体系。但肝细胞在体外培养过程中极易出现"去分化"，从而丧失其代谢酶和转运蛋白的功能活性。因此如何有效维持该模型体系的理想分化状态是体外ADME研究中所亟待解决的"瓶颈"问题。基于再生医学的"微环境诱导理论"，结合题目组前期的工作基础，本课题拟利用组织工程技术体外构建可模拟在体肝组织微环境的人肝细胞三维共培养模型，定性或定量研究不同体外培养微环境因素对肝细胞P450酶和转运蛋白表达调控的影响，在阐明人肝细胞功能活性的体外影响因素的基础上进行相关机制的初步探讨，并采用经优化的三维共培养模型对模式药物的体内药代进行预测分析，建立相应的数学预测模型，最终为体外构建和优化兼具有稳定肝细胞功能活性及体内药代预测价值的体外药代研究模型奠定理论和研究基础。

原代肝细胞是对候选化合物的体外ADME性质进行准确评价的重要模型体系，也是生物人工肝构建中最为理想的供体细胞。但肝细胞在体外培养过程中极易出现“去分化”，从而丧失其原有的生物学活性以及基于代谢酶和转运蛋白的重要功能。因此如何有效维持该模型体系的理想分化状态是体外ADME评价和生物人工肝研发中所亟待解决的“瓶颈”问题。基于再生医学的“微环境诱导理论”并结合题目组前期的工作基础，本课题采用三维共培养技术，以水凝胶或多孔丝蛋白为支架，以原代肝细胞为种子细胞，同时添加ECM和间质细胞（星形细胞和成纤维细胞）成功构建了可部分模拟在体肝细胞微环境的肝细胞-间质细胞三维共培养模型。对照平面培养组和三维单一培养组，该模型内肝细胞不但表现出理想的细胞活性和表型，而且功能活性（包括白蛋白和尿素合成功能、P450酶的代谢活性以及转运蛋白的功能）均显著高于对照组。为了更好的实现模型优化，我们进一步考察了不同微环境条件对所构建体系内肝细胞表型和功能的影响，并深入阐明了其作用关键分子。我们发现：不同的培养支架体系、培养条件（静态或动态培养）以及ECM或间质细胞的添加与否均可不同程度的调控肝细胞但关键转录因子的表达，从而影响其表型及功能活性。其中，间质细胞对肝细胞在体外培养过程中活性与功能的维持“不可或缺”。 本课题研究证明能够更理想维持肝细胞表型与功能的优化培养条件为：选择多孔支架，并添加胶原/基质胶混合ECM和间质细胞，同时应用旋转生物反应器进行动态培养。过程中我们已建立了成熟稳定的三维肝细胞模型构建、表征以及基于多种组合方法的定性及定量检测技术平台；此外，通过构建基于厚度可控的水凝胶平板膜的肝细胞-间质细胞三维共培养体系，我们还进一步阐明了细胞间距离是影响肝细胞-间质细胞相互作用的关键因素，并创新性证明二者间的有效作用距离为30 μm。该实验结果进一步揭示了微环境因素影响肝细胞活性与功能的作用规律，同时也为所有基于实质细胞-间质细胞共培养模型的体外构建提供了非常重要的参考数据并奠定了实验基础。以上结果对深入研究微环境因素对肝细胞活性与功能的调控及其相关分子机制，从而有效克服或延缓“去分化”奠定了重要的工作基础；同时以上三维肝细胞共培养模型的成功建立也为药物ADME筛选与评价提供了新模型，为生物人工肝的体外构建提供了新体系、新方法。