PP2A介导Smad3中间连接区去磷酸化修饰对肾间质纤维化的作用及去甲斑蝥素的干预研究

Smad3蛋白C末端磷酸化是介导TGF-β信号转导，促进肾间质纤维化的关键环节。新近研究发现Smad3中间连接区也可发生磷酸化，却抑制TGF-β信号转导。蛋白磷酸酶(PP2A)能使Smad3中间连接区去磷酸化，但对肾间质纤维化的作用和机制尚不清楚。.去甲斑蝥素(NCTD)被证实是PP2A抑制剂，我们的前期研究原创性发现NCTD具有抗肾间质纤维化和阻断TGF-β/ Smad3信号通路的作用，据此，我们推测：PP2A可能正向调控TGF-β信号，促进肾间质纤维化。本课题拟探讨1) PP2A介导Smad3中间连接区去磷酸化，正向调控TGF-β信号的作用和机制；2）NCTD抗肾间质纤维化是否与其靶向抑制PP2A，削弱PP2A对TGF-β信号的正向调控有关。首次从Smad3中间连接区的去磷酸化修饰角度揭示肾间质纤维化的分子机制，为其防治开辟新思路，并将为NCTD开发成抗肾间质纤维化药物提供理论依据。

Smad3蛋白C末端磷酸化是介导TGF-β信号转导，促进肾间质纤维化的关键环节。新近研究发现Smad3中间连接区也可发生磷酸化，却抑制TGF-β信号转导。蛋白磷酸酶（PP2A）能使Smad3中间连接区去磷酸化，但对肾间质纤维化的作用和抑制尚不清楚。而去甲斑蝥素（NCTD）被证实是PP2A抑制剂，我们前期研究原创性发现NCTD具有抗肾间质纤维化和阻断TGF-β/ Smad3信号通路的作用，据此，我们推测：1) PP2A可能正向调控TGF-β信号的作用和机制；2) NCTD抗肾间质纤维化是否与其靶向抑制PP2A，削弱PP2A对TGF-β信号的正向调控有关。本研究通过体外和体内实验研究PP2A介导smad3中间链接区去磷酸化修饰对肾间质纤维化的作用及去甲斑蝥素的影响。结果发现：（1）PP2A在UUO模型大鼠及TGF-β刺激HK2细胞中的表达增加，并与肾间质纤维化呈正相关。（2）在过表达PP2A质粒干预下UUO模型大鼠及TGF-β刺激的HK2细胞PP2A表达上调，FN、Col-I和α-SMA表达进一步升高，而E-cadherin表达下降，纤维化水平较模型组明显加重，而PP2A阻断剂冈田酸及小干扰PP2A质粒干预下UUO模型大鼠及TGF-β刺激的HK2细胞PP2Ac mRNA和蛋白表达下调，同时FN、Col-I、α-SMA mRNA和蛋白表达下调，E-cadherin mRNA和蛋白表达上调，肾间质纤维化缓解，NCTD抑制PP2A表达及其作用。（3）过表达PP2A质粒干预下TGF-β刺激的HK2细胞PP2A表达上调，而细胞总蛋白和核蛋白中的pSmad3-L（Ser204）和pSmad3-L（Ser208）则明显下调；转染PP2Ac si-RNA后，PP2Ac表达受抑制的同时总蛋白和核蛋白中pSmad3-L（Ser204）和pSmad3-L（Ser208）蛋白表达均增加，NCTD抑制PP2A表达及其作用。这些研究结果提示：（1）PP2A正向调控肾间质纤维化及EMT；（2）PP2A通过去磷酸化smad3中间连接区调控TGF-β信号通路而调控肾间质纤维化及EMT；（3）NCTD通过靶向抑制PP2Ac介导samd3中间连接区实现抗肾间质纤维化及EMT作用。