miRNAs介导的自噬抑制在类鼻疽杆菌感染免疫逃逸中的作用机制研究

Burkholderia pseudomallei is the causative agent of melioidosis, which is a potential threat to public health and south china sea conflict. The intracellular bacterium B. pseudomallei can escape from the vacuole and replicate within the host-cell cytosol which causing multidrug resistant and complicating treatment. Autophagy has been identified as an effective innate immune response to control the B. pseudomallei by enhancing intracellular bacterium clearance. However, the mechanism by which B. pseudomallei infection persist is not clear. In this study, we showed that three novel miRNAs- - -miR-4458, miR-4667-5p and miR-4668-5p by using microarray assay are upregulated in response to B. pseudomallei infection. And the autophagy-mediated anti-B. pseudomallei response is inhibited. As a potential mechanistic explanation for this observation, we demonstrate that miR-4458, miR-4667-5p and miR-4668-5p directly target ATG10, which is the important protein involved in autophagy. Furthermore, we aim to clarify the mechanism of autophagy inhibited by B. pseudomallei in vivo and in vitro, and search for new approaches to the treatment of B. pseudomallei infection to provide theoretical guidance.

类鼻疽杆菌(Bp)感染严重威胁公共卫生和国家南海战略。作为一种胞内病原菌，有效逃逸机体免疫清除是Bp感染与致病的前提；而自噬是机体清除胞内感染病原发挥天然免疫的重要手段，miRNAs介导的病原与宿主相互作用成为二者免疫博弈的重要战场。课题组前期通过芯片筛选和功能实验验证发现Bp感染后宿主细胞miR-4458、miR-4667-5p、miR-4668-5p表达上调，自噬受抑，从而影响了Bp的清除，但机制未明。本项目拟在Bp感染的细胞和动物模型中，通过真核转染上调或下调这些miRNAs，采用WB、激光共聚焦、电镜、流式、EMSA等技术，研究其抑制自噬的具体信号通路以及其转录表达调控，观察其影响清除Bp的能力，探讨"B. pseudomallei、microRNAs与自噬"的作用模式，以期阐明miRNAs介导的自噬抑制在Bp感染免疫逃逸中的作用机制，为寻找其有效的治疗药靶提供线索。

类鼻疽（Melioidosis）是由类鼻疽杆菌（Burkholderia pseudomallei，全称为类鼻疽伯克霍尔德氏菌）所引起的一种人兽共患传染病。该疾病可通过呼吸道、消化道、皮肤传播，主要侵犯人体肺部，可造成肺炎、肺脓肿以及肺部空洞，严重者可快速发展为败血症，由于其诊断难、致病强、治疗难、潜伏长，死亡率高达40%；其流行区域主要集中分布在南、北纬二十度内，涵盖澳大利亚、新加坡、马来西亚、泰国等地区以及我国海南、香港、台湾、广东等南海及台海等主要战略方向，现越来越多的证据表明它是一种正在扩散的人兽共患传染病。海南国际旅游岛的开发、“一带一路”的建设以及南海海洋主权维权和经济安全保障等已上升至国家战略要求，加强类鼻疽研究具有重要的社会意义和军事价值。.课题组前期研究发现类鼻疽杆菌感染肺上皮细胞A549后，自噬水平较未感染组明显减弱；通过mRNA表达谱芯片筛选发现自噬相关基因ATG10下调最显著。进一步miRNA表达谱芯片筛选分析，结果发现三种未被报道的miRNAs：MIR4458、MIR4667-5p、MIR4668-5p，它们可在3个不同的感染时间点分别靶向自噬信号通路的关键分子ATG10，提示类鼻疽杆菌可能通过改变宿主细胞的miRNAs表达谱，干扰宿主细胞自噬，实现逃避机体免疫清除的目的。为此提出如下机制设想：类鼻疽杆菌感染宿主细胞后，转录调控元件受到激活，上调MIR4458、MIR4667-5p、MIR4667-5p的表达，MIR4458、MIR4667-5p、MIR4667-5p通过实时连续下调自噬通路中的信号蛋白ATG10而发挥持续性抑制作用，从而影响类鼻疽杆菌的清除，导致类鼻疽杆菌在宿主细胞中生存繁殖而发生持续性感染，引起难治性肺炎、多发性脓肿，甚至全身败血症等疾病。通过本项目的开展，获得以下研究结果：1）类鼻疽杆菌感染A549细胞后自噬受抑；2）类鼻疽杆菌通过下调ATG10抑制自噬；3）类鼻疽杆菌通过上调MIR4458、MIR4667-5p、MIR4668-5p抑制自噬；4）类鼻疽杆菌感染后引起的MIR4458、MIR4667-5p、MIR4668-5p启动子区域CpG岛甲基化水平降低与其表达调控有关。