小黑杨细胞周期蛋白基因PsnCycD1;1调控网络的研究

We cloned a D-type cyclin from Populus simonii × P. nigra, named as PsnCycD1;1..We introduced this gene into genome of poplar to induce overexpression. The transgenic poplar showed significant changes in phenotype when compared to wild type, such as slow growth, curved stem. We identified 53 differentially expressed genes between transcriptome of transgenic and wildtype plants, which were supposed to be involved in overexpression of PsnCycD1;1. These genes were involved in DNA duplication, signal transduction and cell wall biosynthesis. In present study, we focus on the relationships between the 53 genes and PsnCycD1;1 and hope to find its upstream regulator, at last we will address the network of PsnCycD1;1 and mechanism of phenotype changes in transgenic plant. The aim of the study is to reveal the mechanism of PsnCycD1;1 regulating the cell cycle and changing phenotype, we hope our study will contribute to the molecular breeding of poplar.

本课题组从小黑杨（Populus simonii × P. nigra）中克隆到一个D类周期蛋白基因，命名为PsnCycD1;1。该基因在杨树中过量表达导致转基因植株表型发了明显变化，比如生长缓慢、茎干弯曲等特征。通过PsnCycD1;1基因过表达转录组筛选出了53个与PsnCycD1;1基因显著相关的差异基因，这些差异基因主要参与DNA复制、信号转导、细胞壁物质合成等过程。本课题组拟鉴定与验证这些差异蛋白是否与PsnCycD1;1互作，并找出PsnCycD1;1上游转录因子，绘制PsnCycD1;1基因的调控网络，并探讨转基因杨树茎干弯曲等表型变化的原因。本研究通过揭示PsnCycD1;1基因如何调控植株表型变化的分子机理，为杨树分子育种提供理论依据。

本研究从过表达PsnCycD1;1基因小黑杨微观形态、差异基因的PCR验证、互作蛋白的筛选以及2个差异基因的功能验证4个方面阐述了PsnCycD1;1基因影响小黑杨表型变化的分子机理。具体内容如下：过表达PsnCycD1;1基因小黑杨出现偏心生长、纤维细胞形体改变、细胞壁变厚等微观结构变化；定量PCR检测发现PsnCYCD1;1基因的过量表达导致杨树中其他D类周期蛋白、周期蛋白激酶、周期蛋白激酶抑制因子、下游分裂基因及纤维素发育、木质素发育相关基因的转录水平变化；酵母双杂交与双分子荧光互补实验筛选出PsnCDKA1、PsnICK3和PsnICK5为PsnCYCD1;1的互作蛋白。同时，进一步研究了小黑杨PsnCycD1;1的调控基因PsnHB13与PsnHB15。定量PCR结果表明，两基因均随着PsnCycD1;1基因表达量升高而升高。组织特异性分析表明，PsnHB13基因和PsnHB15基因在小黑杨茎部的表达量相对其他部位最高。酵母双杂交互作验证结果表明，PsnHB15与PsnCycD1;1之间不存在相互作用，PsnHB13与PsnCycD1;1存在相互作用，PsnHB13与PsnHB15存在相互作用。通过农杆菌介导的叶盘法将以上两个基因转入野生型烟草，发现PsnHB13基因主要对烟草叶片、根系及花的生长发育起到重要调控作用，PsnHB15基因影响烟草植株叶片的生长发育从而改变叶形。此外PsnHB13基因过量表达转基因小黑杨明显促进了叶片与茎部的干物质积累，转基因植株明显变矮。