整合素信号通路在白斑综合征病毒侵染对虾过程中的作用研究

The worldwide shrimp culture is beset with diseases mainly caused by white spot syndrome virus (WSSV) and suffered huge economic losses, which bring out an urgent need to elucidate the mechanism of WSSV infected host cell to design of new antiviral drugs against WSSV. In the present project, the molecular biology and immunology methods are employed (1) to study the effects of integrin and ILK on caveolae dynamics in Litopenaeus vannamei challenged by WSSV, (2) to elucidate the interactions of integrin and ILK in vivo and vitro, and (3) to determine the influence of ILK signaling pathway on host cell apoptosis and WSSV replication through function blocking technique. The results of this study not only can ascertain the mechanism of integrin and ILK signaling pathway during the process of WSSV infecting host cell, but also can offer important scientific data which are significant to explore effective preventive methods.

对虾白斑综合征病毒（WSSV）严重威胁对虾养殖业发展，但对WSSV侵入宿主细胞的过程仍不十分清楚，严重限制了有针对性的新型抗病毒药物的研发。开展WSSV侵染对虾生理过程的研究，寻找阻断WSSV感染的潜在靶点，对防治WSSV具有重要意义。本项目以凡纳滨对虾为研究对象，拟通过分子生物学和免疫学等方法，研究对虾感染WSSV时，integrin和ILK对细胞膜穴样凹陷（caveolae）动力学的影响，探讨integrin和ILK在对虾体内的相互作用关系，并通过功能封阻手段研究ILK信号通路对宿主细胞凋亡和WSSV复制增殖的影响。通过以上研究，不仅能够查明integrin及其介导的ILK信号通路在WSSV侵染对虾过程中的作用机制，还能够为探索有效防治途径提供重要科学依据。

本项目以凡纳滨对虾为研究对象，通过分子生物学和免疫学等方法，研究对虾感染WSSV时，integrin和ILK对细胞膜穴样凹陷（caveolae）动力学的影响，探讨integrin和ILK在对虾体内的相互作用关系，并通过功能封阻手段研究凡纳滨对虾和克氏原螯虾ILK信号通路对宿主细胞凋亡和WSSV复制增殖的影响。结果主要分为三部分：.第一部分：本研究首次从对虾体内克隆到ILK基因，命名为LvILK，LvILK cDNA全长1068bp，其中5′UTR为21 bp，3′UTR为66 bp，开放阅读框为981bp，编码326个氨基酸。LvILK氨基酸具有典型的ANK结构域和STYKc蛋白激酶序列。BLAST同源性分析发现，LvILK与其他物种的ILK具有较高相似性。WSSV感染对虾后，血淋巴细胞内LvILK基因的表达显著下调，表明WSSV可能通过影响对虾体内的ILK信号通路来完成自身的复制。.第二部分：利用RNA干扰技术降低Lvintegrin和LvILK基因的表达，并在此基础上用WSSV进行侵染实验，结果显示，通过透射电子显微镜检测的caveolae数量未发生明显变化；RNA干扰技术降低Lvintegrin基因的表达后，无论是否有WSSV感染，LvILK的mRNA和蛋白表达水平都显著降低。由此可见，无论是否有WSSV感染，Lvintegrin都可以调控LvILK的表达水平。而CoIP实验检测未发现LvIntegrin与LvILK在对虾血淋巴细胞内有结合作用。.第三部分：利用特异性的PI3K抑制剂 LY294002预处理凡纳滨对虾和克氏原螯虾，然后感染WSSV，病毒的拷贝数显著降低。克氏原螯虾用LY294002预处理后，无论是否有WSSV感染，其凋亡率都显著降低。凋亡相关因子Bax mRNA和Bax inhibitor-1 mRNA的表达水平显著增加，模式识别受体Toll mRNA表达明显下调、lectin表达显著上升。. 结果表明：PI3K/Akt信号通路的阻断可抑制凡纳滨对虾和克氏原螯虾体内WSSV病毒的复制，并且通过PI3K/Akt信号通路平衡宿主细胞凋亡和免疫反应，这些共同决定了WSSV感染宿主的命运。