染色质环境下DNA双链断裂修复调控机制

Properly fixing DNA double strand break (DSB) is essential for cells to maintain their genome integrity, hence avoiding potential tumorigenesis and stress induced premature cellular senescence. Although intensive studies have been performed to understand the molecular mechanisms of two pathways- nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR)- responsible for repairing DNA DSBs, much less attention has been paid to the regulatory mechanisms of the two pathways under the chromatin context due to a lack of appropriate tools. Here, our lab developed a novel reporter cassette, which simultaneously measures repair efficiencies of two pathways at the same genome loci. Furthermore, we created 15 cell lines with the reporter integrated into various chromosomal positions. Using the cell lines, we propose the following specific aims in this study. Aim 1: to systematically analyze the correlation between nucleosome density or histone modifications and DNA repair efficiency and accuracy. Aim 2: to identify factors regulating the change of nucleosome density in response to DNA DSBs, and further elucidate the molecular mechanism. Aim 3: to study the regulatory mechanisms of DNA DSB repair by factors targeting or recognizing specific types of histone modifications.

正确修复DNA双链断裂可防止细胞内重要遗传信息丢失，进而避免细胞癌化或者老化。尽管负责修复此种损伤的两条通路-非同源末端连接和同源重组的机制已经被广泛研究，但是由于缺少合适的研究方法，这两种修复通路在染色质环境下如何被调控尚未被深入探索。申请者课题组发展了在同一基因组位点同时检测非同源末端连接和同源重组的报告系统，并构建了15株在不同基因组位置整合了单拷贝载体的报告细胞系。基于该独特的研究系统，申请人计划研究：（1）核小体密度以及特定组蛋白修饰与双链断裂修复效率以及精确性是否存在相关性；（2）DNA双链断裂损伤发生时相关蛋白调控核小体密度从而影响DNA双链断裂修复的分子机制；（3）DNA双链断裂发生时相关表观遗传因子及其它蛋白调控组蛋白修饰从而影响DNA双链断裂修复分子机制。

DNA双链断裂损伤是最为严重的一种DNA损伤，错误或者不能够修复此类损伤可导致细胞衰老及肿瘤细胞的发生。细胞发展了两种独立但是竞争的修复通路——同源重组（HR）以及非同源末端连接（NHEJ）——完成这类损伤的修复，但是真核生物中DNA通常为核小体所包裹，在染色质环境下双链断裂损伤修复如何完成的分子机制尚未被深入阐述。在该项目中，我们为了回答该科学问题，首先建立了能在基因组同一位置同时检测HR和NHEJ效率的报告系统，并通过多种手段证明了该系统能够正确反映HR和NHEJ修复效率。利用该报告系统，我们建立了15株整合了报告系统的永生化的人成纤维细胞系，并基于该细胞系，我们发现了HR而非NHEJ效率与其所在染色质位置的核小体密度呈现负相关。后续研究提示PARP1直接参与DNA双链断裂损伤修复且其调控步骤在DNA损伤应答和末端重排之间，因此我们推测其能够影响核小体密度进而调控HR修复。进一步机制研究提示PARP1确实可通过调控核小体密度进而促进HR修复。质谱分析实验数据提示PARP1在DNA损伤发生后形成的PAR链可与具备ATPase酶活活性的染色质重塑因子BRG1以及去乙酰化酶SIRT1存在潜在相互作用。深入的机制研究发现PAR链能够与BRG1的ATPase区域互作促进其招募至损伤位点，其亦能通过与SIRT1的ZnF区域结合促进SIRT1到达DNA损伤位点。在DNA损伤位点SIRT1能够去乙酰化BRG1的1029和1033位点的赖氨酸，从而提升BRG1的ATPase酶活活性，促进DNA损伤位点核小体密度的松散，进而提高HR修复效率。相关工作为PARP1抑制剂应用于治疗具有完整HR修复能力的肿瘤奠定了理论基础。