麻黄多糖UPLC-MS结构特征图谱和谱效关系研究

Ephedra polysaccharide has a significant immunosuppressive action, which is the bitter and cold material basis of Mahuang. Also, ephedra polysaccharides have the complex chemical structures so that it makes the quality evaluation of ephedra polysaccharides become a bottleneck problem. This project focuses on using ultra high performance liquid chromatography (HPLC)-mass spectrometry (UPLC-MS) to establish a simple, rapid and accurate analytical method that it is able to simultaneously determine many kinds of monosaccharide and oligosaccharides; at the same time, using ephedra polysaccharide as the study object, to establish multiple structural features profiles to reflect the intrinsic quality of the ephedra polysaccharide by established analytical methods based on complete acid hydrolysis, partial acid hydrolysis and specific enzyme hydrolysis; and through detection of carbon clearance index and mice lymphocyte proliferation using mice carbon clearance test and MTT, to remain further investigate the fingerprint bioactivity relationships between UPLC-MS structural characteristic fingerprint and immunosuppressive activity, to find out the correlation and the laws of science between the Mahuang structural characteristic fingerprint and pharmacodynamic effects, to provide new ideas and methods for quality control of Chinese medicine polysaccharides. In view of the quality evaluation methods of Chinese medicine polysaccharide, there are no a proven and effective method in China and abroad. After completion of the project, it may provide a reference of draft guidelines for quality control and evaluation technology of Chinese medicine polysaccharides for State Pharmacopoeia Commission and Chinese medicine enterprises.

麻黄多糖具有显著的免疫抑制作用，为麻黄苦寒性味的物质基础。而麻黄多糖化学结构复杂，使得麻黄多糖的质量评价成为困扰其发展的一个瓶颈问题。本项目首先利用超高效液相色谱-质谱(UPLC-MS)建立一种对多种单糖和寡糖完全基线分离的简单、快速、准确、灵敏度高、重现性好的高通量样品分析方法；同时以麻黄多糖作为研究对象，对其进行全水解、控制性水解和特异性酶水解，检测水解产物，建立反映麻黄多糖内在质量的多张结构特征图谱；并通过小鼠碳廓清实验和噻唑蓝法检测麻黄多糖对碳廓清指数和小鼠淋巴细胞增殖的抑制作用，深入考察麻黄多糖UPLC-MS特征图谱与其免疫抑制活性之间的谱效关系,阐明麻黄多糖特征图谱与药效之间的相关性及科学规律，为中药多糖质量控制提供新的研究思路和方法。鉴于目前国内外尚没有合理的中药多糖的质量评价方法，该项目完成后，可能为国家药典委员会和中药企业提供可参考的中药多糖质量控制和评价技术指南草案。

本项目首先建立了亲水相互作用-超高效液相色谱-三重四级杆质谱(HILIC-UPLC-MS)分析方法，HILIC-MS通过质谱检测糖类化合物(0,3)位跨环裂解碎片离子，不需要糖类化合物的柱前衍生，具有专属性强、前处理简单等优点。然而该方法色谱分离单糖异构体困难，因此其仅适用于糖组成简单的多糖单体。同时，本项目建立了基于PMP柱前衍生的UPLC-UV和UPLC-MS/MS色谱检测分析方法，经PMP衍生化的单糖或寡糖能明显提高其检识度，并且采用响应曲面法优化了PMP衍生条件。PMP-UPLC-UV和UPLC-MS/MS糖分析方法亦具有简单、快速、重现性好等特点，并且更适合复杂多糖的分离和检测。因此，本项目以麻黄多糖作为研究核心，对其进行完全酸水解、温和酸水解和多种特异性酶降解，利用PMP-UPLC-UV和PMP-UPLC-MS/MS分析方法检测其降解产物，建立了反映麻黄多糖内在质量的完全酸水解特征图谱、梯度温和酸水解特征图谱和多种特异性酶降解特征图谱。结果表明：利用UPLC-UV结合多元统计学分析对源自麻黄、牛膝、酸浆、地榆和连翘等五种中药多糖进行了成功区分和辨别；采用PMP-UPLC-MS/MS结合多元统计学分析对麻黄属植物多糖（中草麻、中麻黄、木贼麻黄和麻黄根）进行了成功区分和辨别。并通过小鼠碳廓清实验和噻唑蓝法检测麻黄多糖对碳廓清指数和小鼠淋巴细胞增殖的抑制作用，对各种麻黄多糖的UPLC-MS组成糖图谱与免疫抑制活性的谱效关系进行了研究，发现糖醛酸的含量对麻黄多糖的活性影响较大。进而，通过多元线性回归分析来剖析不同麻黄多糖（总多糖、不同分子量多糖组分、单体多糖）其UPLC-MS组成糖特征与免疫活性之间的关系，表明半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸、葡萄糖和木糖可能为麻黄免疫抑制多糖重要的活性因子。本项目揭示了麻黄多糖组成糖特征与药效之间的相关性及科学规律，研究成果可能为中药多糖的质量控制提供了新的研究思路和方法。项目组成员共参加国内外学术会议4次，大会报告2次；正式发表研究论文5篇，其中SCI论文1篇；另1篇SCI论文正在同行评阅中；部分研究成果获得中华中医药学会科技二等奖1项、省优秀博士后出站报告1份；培养硕士研究生5名。