海马齿状回神经元型一氧化氮合酶表达中间神经元的生理学研究

The hippocampus plays a critical role in higher brain functions such as learning and memory. The dentate gyrus receives information from the entorhinal cortex via perforant path and projects onto CA3 pyramidal cells via mossy fibers. In addition to granule cells, the dentate gyrus also contains GABAergic interneuorns and mossy cells. GABAergic interneurons in the dentate gyrus function to maintain excitatory/inhibitory balance via both feedfoward and feedback inhibitions and are also involved in learning and memory processes probably through affecting sparse coding. Our previous study has demonstrated that neuronal nitric oxide synathase (nNOS)-expressing cells are predominant subpopulation of GABAergic interneuorns in the rat dentate gyrus and in addition,approximately two-thirds of nNOS-positive interneurons in the molecular layer do not express calcium-binding proteins and neuropeptides. We hypothesize that nNOS-expressing interneurons play important roles in feedforward inhibition and granule cell assembly in response to perforant path stimulation. This project aims to explore the intrinsic electrophysiological properties, morphological features, synaptic connectivity, and physiological functions of nNOS-expressing cells in the dentate gyrus by using GAD67-GFP knock in mice in couple with patch clamp recordings, single cell reverse transcription polymerase chain reaction, biocytin-mediated cell labeling, nNOS-expressing cell phototoxicity and optogenetics.

海马在学习和记忆等高级脑功能中起关键作用。齿状回是内嗅皮层信息传递至海马的主要门户，对来自内嗅皮层的信息进行处理后通过苔藓纤维传递到CA3锥体细胞。除颗粒细胞外，齿状回还含有gamma-氨基丁酸（GABA）能中间神经元和苔藓细胞。GABA能中间神经元除通过前馈和反馈机制维持齿状回神经网络兴奋和抑制的平衡外，还通过影响稀疏编码参与学习和记忆。我们的前期研究发现神经元型一氧化氮合酶（nNOS）表达细胞是齿状回中主要的中间神经元亚型之一，而且在齿状回分子层存在不表达钙结合蛋白或神经肽的nNOS阳性细胞。我们假设nNOS表达中间神经元在前馈抑制和稀疏编码中起重要作用。本申请拟使用GAD67-GFP敲入鼠，结合膜片钳记录、单细胞反转录PCR、生物素细胞标识、nNOS表达细胞光毒性以及光遗传学技术研究齿状回nNOS表达中间神经元的内在电生理学性质、形态学和轴突投射特征以及在齿状回神经网络中的作用。

在脑内，90%以上的中间神经元为GABA能细胞。除通过负反馈和前馈机制实现神经抑制外，中间神经元还参与细胞同步化的控制、网络振荡的形成以及神经网络活动中的细胞募集等。中间神经元功能异常与癫痫形成、自闭症、精神分裂症以及老年痴呆的发生和发展有密切关系。因此，标识GABA能中间神经元是研究GABA能中间神经元功能的基础。免疫组化共聚焦成像结果显示，和谷氨酸脱羧酶67（GAD67）GABA能中间神经元相比，GAD65 GABA能中间神经元胞体更易于辨认，标识更多，可更好地用于标识和定量GABA能神经元。在此基础上，我们进一步研究了癫痫持续状态（SE）发作时以及自发癫痫动物GABA能中间神经元的立早基因表达的改变。结果显示，癫痫持续状态伴有广泛的齿状回GABA能神经元激活，表达一氧化氮合酶（nNOS）、神经肽（NPY）、小白蛋白（PV ）和生长抑素（SOM）四种不同神经化学类型的GABA能中间神经元表达c-fos的百分比都较对照组为高，其中小白蛋白阳性细胞中，c-fos表达的百分比最高也最强。立早基因表达和电生理学研究结果持续的GABA能神经元高兴奋性可通过增加兴奋性主细胞内的氯离子积聚导致GABA平衡电位向去极化方向移动，导致痫性活动的出现。