转铁蛋白靶向脂质体转载VEGF、SDF-1及HOXD3基因治疗大鼠缺血性脑卒中

转铁蛋白靶向脂质体（Transferrin targeted Pegylated-liposomes，Tf-PLs）是一种可以将一些大分子药物或基因跨血脑屏障转运至脑内非常有效的载体，并且在某些动物的体内实验方面取得了一定的成效。但是，迄今为止，尚没有文献报道将血管内皮生长因子（VEGF）、基质细胞衍生因子-1（SDF-1）、内皮同源盒基因（HOXD3）和脂质体结合起来治疗缺血性脑卒中的相关研究。本研究拟结合脂质体载体制备技术，构建经静脉内给药、具有脑靶向性的转基因载体，将VEGF、SDF-1和HOXD3基因转入缺血性脑卒中的大鼠脑内，研究其转录表达后脑血管发生的形态学变化和远期大鼠神经功能康复状况，评价三者转录后在脑保护作用中的机制。此项研究在于评价经静脉途径脂质体转录效能，以及为脑缺血的基因治疗探讨一种新的联合治疗选择方案，为基因治疗人类疾病提供新思路。

在本项课题研究中，我们将SDF-1和VEGF通过转铁蛋白靶向的脂质体同时注射至缺血性脑卒中大鼠体内后，观察两个基因的联合作用，对脑缺血大鼠的发挥神经保护作用及神经营养因子表达的调节。首先，携带SDF-1和VEGF的Tf-PLs粒径大小约100nm左右，通过对其物理特性的检测，符合纳米治疗的要求，具有符合实验要求的稳定性，并且将携带有GFP报告基因的Tf-PLs注射至脑缺血大鼠体内后，可以实现报告基因跨越血脑屏障在脑内表达的要求。接受Tf-SDF-1+VEGF-PLs注射的脑缺血大鼠，经过21天的观察，神经功能评分逐渐降低，提示神经功能逐渐恢复，与对照组相比，评分结果具有显著性差异。脑缺血7天后行TTC染色，Tf-SDF-1+VEGF-PLs注射组与对照组相比具有更小的脑缺血面积。通过对脑缺血半暗带周围的神经元数量的染色，我们发现Tf-SDF-1+VEGF-PLs注射组的神经元数量远远多于对照组。我们通过BrdU免疫荧光染色与神经元的特异性标记物NeuN共聚焦，发现Tf-SDF-1+VEGF-PLs注射组的增殖细胞多于对照组。共聚焦结果提示，Tf-SDF-1+VEGF-PLs注射组有更多的神经元为新增殖，说明Tf-SDF-1+VEGF-PLs可以促进神经元的增殖。另一方面，神经元的再生与神经功能的恢复，离不开血管对养分的供应，因此我们对脑缺血后新生血管进行了检测。结果证实Tf-SDF-1+VEGF-PLs注射组可以促进更多的血管再生，考虑原因有：SDF-1高表达可以促进更多的血管前体细胞迁移到脑缺血部位进一步分化成血管，而VEGF本身也可以促进血管增生。当神经再生、血管增殖的情况下，脑缺血局部脑血流量的大小成为了决定脑缺血部位是否可以得到足够的养分供给，弥补脑缺血后供血不足的关键因素。我们利用多普勒超声仪对脑缺血大鼠脑皮质血流量进行了测量，结果提示Tf-SDF-1+VEGF-PLs注射组可以显著提升局部脑血流量，促进脑内组织代谢，加快神经缺损功能的恢复。