胰岛素受体PTPRA对HCV感染过程中病毒入胞的调控及其分子机制研究

Hepatitis C virus (HCV) invasion is a highly sophisticated and dynamic process. The precise interaction mechanism of the binding process between HCV and a variety of cell surface-specific receptors, simultaneously or sequentially, is not completely understood. There may be some uncharted specific receptors in cell surface contributing to the HCV infection. We have previously established a unique and efficient HCV infection model based on blood borne HCV (bbHCV) and human fatal liver stem cells (hFLSCs), and discovered the closed relationship between insulin and HCV infection. The meta-analysis also indicated the greater risk of HCV infection occurring among Type II Diabetes Mellitus. The differential proteomics results further proved the point that HCV infection was indeed closely related to the insulin receptor PTPRA on the surface of hFLSCs. Therefore, we speculate that the PTPRA on the cell surface might be a new receptor for HCV infection. HCV could identify and combine PTPRA, then activate the insulin signaling pathway, finally lead to the infection. In order to validate this hypothesis, we intended to combine proteomic screening, forward/reverse validation in molecular biology and other biological research methods to figure out the actual role of PTPRA towards HCV infection during the invasion and cell-to-cell transmission process. Furthermore, we selected receptor-specific inhibitors to evaluate the antiviral effect. This proposal will contribute a lot to further revealing the infection mechanism of HCV and its relationship with insulin metabolism, and help to provide a new antiviral site for the treatment of HCV infection.

丙型肝炎病毒（HCV）入侵细胞是一个高度复杂和动态的过程，其与细胞表面多种特异性受体同时或顺序的相互作用机制尚不完全清楚，细胞表面可能还存在未发现的特异性受体辅助病毒感染。申请人前期建立了独特的血源性HCV-人胚胎肝干细胞（bbHCV-hFLSCs）高效感染模型，发现胰岛素与HCV感染密切相关，系统分析也表明二型糖尿病患者HCV感染率明显升高，进一步利用差异蛋白质组学发现HCV与hFLSCs表面胰岛素受体PTPRA关系紧密。因此，我们推测细胞表面的PTPRA可能是HCV感染的新受体，病毒可以识别并结合PTPRA，激活胰岛素信号通路，辅助其感染。为了验证该假说，项目拟结合蛋白组学筛选，分子生物学正向/反向验证，阐明PTPRA对病毒侵入和细胞间散播过程的影响，并选择受体特异性抑制剂评价抗病毒效应。本项目有助于我们进一步揭示HCV的感染机制及其与胰岛素代谢之间的关系，为HCV感染治疗提供新位点。

本项目利用具有干细胞功能的人胚胎肝干细胞（human Fatal liver stem cells, hFLSCs）建立高效的血清来源的HCV（blood-borne HCV, bbHCV）培养系统。利用蛋白质组学技术在此系统中发现并验证除目前已有的HCV感染相关受体之外的新的感染关键因子：受体蛋白酪氨酸磷酸酶A（Protein tyrosine phosphatases, receptor type A, PTPRA）和载脂蛋白D（Apolipoprotein D, ApoD），并探讨其在病毒侵入和复制过程中的机制。主要研究结果如下：.首先，我们利用蛋白质组学技术结合生物信息学分析，最终筛选和发现PTPRA和ApoD与bbHCV感染密切相关。针对新鉴定的PTPRA和ApoD，bbHCV感染后RT-qPCR检测PTPRA和ApoD的表达发现其明显升高；siPTPRA可以降低病毒进入细胞的量，siApoD则减少了感染后病毒向细胞外分泌的量，但是细胞内病毒RNA却累积增高；并且bbHCV感染后可激活胰岛素信号通路，增加IRS和JNK的磷酸化，最终激活Akt导致细胞内脂肪酸合成增加，细胞内脂滴增多。.其次，PTPRA抑制剂Peroxyacid可以降低bbHCV及其子代病毒在hFLSCs和Huh-7.5.1中的感染，而PTPRA激动剂胰岛素和TNF-α则作用相反。通过构建PTPRA和ApoD表达质粒，发现bbHCV感染转染PTPRA成功的hFLSCs后，病毒进入细胞的速率增加，达到平台期的时间缩短；而感染转染ApoD的hFLSCs，可以观察到病毒向细胞外分泌的速率增加，细胞外病毒可以在感染后18h到达平台期。.第三，利用所构建的质粒转染对bbHCV不感染的肝源Huh-7和非肝源vero细胞后发现：Huh-7细胞在转染了PTPRA之后虽然对bbHCV表现出有一定的感染性，但是细胞分泌病毒的含量依然很低，而单独转染ApoD并未对Huh-7感染bbHCV有所改善；有趣的是vero细胞中表达PTPRA可以使这一株完全不感染bbHCV的细胞对bbHCV产生感染性。上述结果表明我们发现的PTPRA是bbHCV感染必要的一个辅助因子。.综上所述，本研究意义在于为抗病毒药物的作用靶点、临床病毒耐药性机制以及HCV感染细胞模型等研究领域产生理论突破，并为HCV预防疫苗的制备奠定基础。