刺参自溶过程中自噬的TOR通路调控机制及其与凋亡关系的研究

Sea cucumber would initiate the “melting” body wall phenomenon under certain circumstances, which is followed by death. This phenomenon is a major concern for sea cucumber production, particularly during transportation and processing. So far the sea cucumber melting phenomenon research is mainly focus on enzymology field and the mechanism study does not carried out. Previous study showed that this phenomenon is accompanied with the apoptosis and autophagy. Although the apoptosis during sea cucumber melting have got some result, the autophagy signal transduction pathway and its relationship with apoptosis have not been revealed. This project aimed to investigate the relationship of apoptosis and autophagy during sea cucumber melting and the TOR related signal transduction pathway in autophagy. Firstly, the immunohistochemical staining and flow cytometry method would be adopt to establish a detection model of sea cucumber apoptosis and autophagy. This model would facility for the detection of their involving in sea cucumber melting. Secondly, the inhibitor and inducer of apoptosis and autophagy would used to study the relationship of apoptosis and autophagy in the event of melting. Thirdly, the TOR related signal transduction pathway in autophagy would be detected during sea cucumber melting to reveal the molecular mechanisms in this melting. The expressing of TOR, Akt, Atg6, LC3B, UVRAG and p53 during sea cucumber melting would help for the understanding of the signal transport mechanism in molecular level. We hope this project would help for the mechanism reveal of sea cucumber melting in food processing.

刺参在捕捞、运输及加工过程中常发生强烈的自溶现象，这一现象困扰着刺参的加工产业。目前对刺参自溶的研究主要集中于自溶酶的研究方向，对其深层机制研究亟待突破。本研究团队前期研究发现刺参自溶伴随着细胞凋亡和自噬现象。但对自噬机制如何影响刺参自溶进程目前仍然未知。本项目拟从自噬与凋亡关系和自噬TOR相关信号分子传导方向研究刺参自溶机制。首先采用组织染色和流式细胞术建立刺参自噬和凋亡检测模型，以了解两者对刺参自溶的作用；其次采用自噬和凋亡的抑制剂和诱导剂作用自溶的刺参，检测其影响效果，以研究自噬和凋亡在刺参自溶过程中的关系；最后通过对自噬TOR相关信号分子如TOR、Akt的磷酸化以及Atg6和 LC3B等相关信号分子的表达进行研究。通过他们之间表达的作用关系了解刺参自溶过程中相关信号分子的传导机制以及其在刺参自溶过程中的作用原理。以期从分子机制角度理解刺参自溶在加工过程中产生的困扰。

刺参在捕捞、运输及加工过程中常发生强烈的自溶现象，这一现象困扰着刺参的加工产业。前期已有研究表明细胞凋亡机制在刺参自溶过程中扮演着重要作用，但对刺参自溶过程中的自噬现象研究较少，对自噬如何影响刺参自溶了解甚少。本课题通过对刺参自溶过程中自噬事件的检测以理解自噬机制在刺参自溶过程中的作用，采用凋亡和自噬抑制剂处理活体海参并引发自溶以对凋亡和自噬的作用进行深入探索。.研究结果表明，鲜活对照组的刺参体内组织几乎没有自噬标志性蛋白LC3-II和关键蛋白Atg5的表达，但在UV诱导刺参自溶后此两种关键蛋白立即表达并被检测到，但诱导自溶2个小时后又停止表达，几乎检测不到。此外，对自噬小体MDC的染色结果也证实了这一自噬发生规律。这说明刺参自溶过程中自噬的发生是一种应激行为，是一种对刺参健康的挽救行为，而并非自溶的触发事件。对刺参自溶过程中PI3K、Akt、mTOR等信号蛋白的表达行为研究表明，PI3K-Akt-mTOR信号通路被激活，且与细胞自噬变化趋势相同，说明此通路是刺参自噬发生的关键信号途径。.分别采用自噬抑制剂和诱导剂对活体海参进行了灌肠处理并以UV诱发刺参自溶。刺参肠道组织切片结果表明灌注自噬抑制剂组刺参的健康状况明显较差，自溶倾向明显；而灌注自噬诱导剂组刺参肠道结构保持较好，健康状况明显好于自溶对照组。这说明外源自噬诱导剂处理活体刺参能够明显延缓刺参自溶的发生。对刺参自溶过程中凋亡发生情况也进行了检测，Annexin V-FITC结果表明刺参自溶引发后细胞凋亡比率一直升高，此外，采用泛caspase酶凋亡抑制剂处理的活体刺参，也明显的延缓了刺参自溶的发生，这说明细胞凋亡是刺参自溶的主要引发机制。.本研究首次发现，采用外源自噬引发剂或者外源凋亡抑制剂灌注刺参肠道后，可以明显延缓刺参的自溶进程。由于刺参自溶现象的存在使其无法长时间运输，自古以来刺参都是以加工后的产品形式出售。但消费者更青睐鲜活刺参，外源药物灌注刺参能够延长刺参保鲜保活时间，这为延长海参运输时间提供了技术思路。