长链非编码RNA-H19通过竞争性结合miR-181家族和衍生miR-675双通路调控脑胶质瘤EMT进程的机制研究

Epithelial-mesenchymal transition (EMT) plays a critical role in cancer cell invasion. In our previous studies, whole transcriptome sequencing was performed and revealed that H19 was associated with malignant progression, clinical prognosis and EMT process in glioma. Bioinformatics predicted miR-181s' binding sites in H19.Preliminary studies indicated that H19 siRNA resulted a decrease of invasion ability and regulated the expression of EMT markers.Downregulation of H19 also decreased miR-181s' potential target genes at protein level and H19 encoded miR-675 expression in glioma cells. Here, we propose a hypothesis that H19 may regulate EMT process via functioning as miR-181s sponge and deriving miR-675. Presently, we aim to validate the functional regulation of H19 on EMT process, the competing regulation of miR-181s' target genes and miR-675 mediated EMT regulation network. In summary, our results may provide novel targets and optimize treatment strategies for molecular targeted therapy in glioma.

EMT（上皮间质转化）在肿瘤细胞侵袭过程中起关键作用。我们前期通过全转录组测序发现：长链非编码RNA-H19与胶质瘤恶性级别、患者预后及EMT进程密切相关。生物信息学分析提示H19上存在miR-181家族潜在结合位点。进一步预实验证实：敲低H19可抑制胶质瘤细胞侵袭并调节EMT经典标志物表达水平，同时可降低miR-181家族潜在靶基因的蛋白表达水平及H19 编码的miR-675表达水平。由此我们推测H19作为miR-181家族"分子海绵"及miR-675前体实现对胶质瘤EMT进程的调控。本课题拟通过临床大样本分析、RNA结合蛋白免疫沉淀、体内交联等方法明确H19表达的临床意义及竞争性结合miR-181家族和衍生miR-675双通路介导的EMT进程调控，并分析其调控关系对胶质瘤细胞侵袭等恶性表型的影响。课题可构建H19对EMT进程的多重调控网络，在长链非编码RNA作用模式方面进行有益的探索。

背景及目的：脑胶质瘤是成人最常见的颅内肿瘤。因其易向周围正常脑组织浸润，所以患者术后易复发。上皮间质化（Epithelial mesenchymal transition EMT）是导致恶性肿瘤高侵袭性的重要进程。长链非编码RNA H19的异常表达与多种肿瘤的发生发展密切相关。本研究将重点探究H19在调控恶性胶质瘤上皮间质化进程所发挥的重要作用。方法：首先利用脑胶质瘤样本数据库的分析H19的表达与胶质瘤级别和患者预后的关系。qRT-PCR对临床样本和常用细胞系中H19表达进行检测。通过慢病毒转染敲低或过表达细胞中H19水平，Western blot检测EMT相关蛋白（E-caderin和Vimentin）的表达；细胞功能实验（划痕实验、Transwell侵袭实验、干细胞球形成实验）验证H19表达水平对胶质瘤细胞迁移、侵袭和干性表型的影响。裸鼠原位成瘤实验进一步体内验证H19对胶质瘤发生发展的影响。生物信息学预测与H19结合的miRNA及其下游靶点，并通过双荧光素酶报告基因、RIP等实验进行验证。结果：我们分析发现，长链非编码RNA H19在胶质瘤组织和细胞中高表达，且相对于H19低表达的患者，H19高表达的患者往往预后不良。在人胶质瘤细胞LN229中过表达H19可以促进胶质瘤细胞的侵袭、迁移、胶质瘤干细胞球形成和诱导EMT的发生；在胶质瘤细胞系U87和U251中，敲低H19可以抑制胶质瘤细胞的侵袭、迁移、胶质瘤干细胞球形成和EMT的进程。此外，在裸鼠的原位成瘤实验发现，敲低H19可以抑制裸鼠胶质瘤的生长。进一步，我们发现，H19可能是通过竞争性结合miR-130a-3p，从而调控SOX4的表达，影响EMT进程。结论： 本课题揭示了H19作为促癌基因调控胶质瘤发生发展的重要作用，为胶质瘤的治疗提供了一种潜在的新策略。