丙二醛氧化修饰影响扁桃苦杏仁球蛋白过敏性质的分子机理研究

Almond, mainly planted in Southern Xinjiang area, is a high-value but high allergenicity food which led to a serious health problem. Amandin has been identified as the major allergen in Almond. The results of previous research revealed that amandin crude extract structure had changed after oxidation, but the influence of oxidation modification of amandin to its allergenicity and the underlying mechanism is not clear. Based on the structure of oxidized amandin, the oxidation reaction sites will be recognized by the oxidation reaction sites, the relationships between the structure and the allergenicity of amandin will be characterized by identify the oxidation reaction sites. Firstly, amandin will be purified using biochemical separation technique, and then it will be oxidized by malondialdehyde. Oxidation induced changes of the molecular properties, secondary and tertiary structure of amandin will be analyzed by carbonyl content, free sulphydryl and total sulphydryl content, DSC, SDS-PAGE, circular dichroism spectra, fourier transform infrared spectroscopy, fluorescence spectra, etc. Biological mass spectrometry will be carry out to identifying the reaction sites of covalent crosslinking and fracture of oxidized amandin. The changes in the allergenicity of them will be measured by ELISA and immunoblotting test. Then, the stability of oxidized amandin will be explored by simulating artificial gastrointestinal digestive juice, and its stimulating ability of degranulation of basophils will also be measured. This study is critical for establishing the scientific basis of controlling almond allergies.

扁桃在中国的主产区为新疆南疆地区，营养丰富，但其高致敏性可导致严重的健康问题。扁桃苦杏仁球蛋白是扁桃主要的过敏原之一，前期研究表明氧化后苦杏仁球蛋白粗提物的结构发生了改变，但苦杏仁球蛋白的氧化修饰对致敏性的影响及相关分子机理尚无系统研究。本项目在氧化苦杏仁球蛋白结构研究的基础上，通过对氧化位点的分析，阐明苦杏仁球蛋白致敏性变化与结构的关系。首先采用生化分离方法纯化扁桃苦杏仁球蛋白，并用丙二醛对其进行氧化；随后借助羰基、总巯基、游离巯基、DSC、SDS-PAGE、圆二光谱、荧光光谱等技术研究氧化所引起的苦杏仁球蛋白分子特性、以及二和三级结构的变化，并用生物质谱法解析氧化苦杏仁球蛋白分子交联或裂解的位点；并采用ELISA和免疫印迹法评估它们的致敏性；进一步用模拟人工胃肠消化液对氧化苦杏仁球蛋白的稳定性进行分析，同时测定它对嗜碱性粒细胞的脱颗粒能力。研究成果将为扁桃致敏性控制提供理论依据。

扁桃在中国的主产区为新疆南疆地区，营养丰富，但其高致敏性可导致严重的健康问题。扁桃苦杏仁球蛋白是扁桃主要的过敏原之一，前期研究表明氧化后苦杏仁球蛋白粗提物的结构发生了改变，但苦杏仁球蛋白的氧化修饰对致敏性的影响及相关分子机理尚无系统研究。杏仁富含47-50%的脂质，在食品加工及贮藏过程脂质极易氧化，从而间接诱导蛋白质氧化。丙二醛（MDA）是脂肪氧化主要的次级产物之一，能氧化蛋白质的侧链和多肽骨架，造成蛋白质空间结构的变化，从而改变其功能特性及潜在致敏性。本项目通过丙二醛氧化诱导苦杏仁球蛋白（amandin），研究氧化对苦杏仁球蛋白的理化、结构及潜在致敏性的影响，进一步探究表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）消减苦杏仁球蛋白潜在致敏性的机理。MDA氧化改变了amandin的结构，并降低氨基酸总含量，使蛋白质通过疏水相互作用及共价键等发生聚集和交联。LC-MS/MS研究发现经1.0 mmol/L MDA氧化诱导的苦杏仁球蛋白线性表位含量最少。Gamma conglutin 1中检测出四种肽段中的蛋氨酸被氧化。通过LC-MS/MS检测发现苦杏仁球蛋白主要通过半胱氨酸和谷氨酸残基与EGCG进行共价结合，从而降低苦杏仁球蛋白潜在的致敏性。本项目旨在为杏仁在生产加工过程中氧化调控及消减其致敏性提供理论基础。