烷基化一氧化氮调控可溶性鸟苷酸环化酶的结构基础与分子机制研究

The dysfunction of NO-sGC-cGMP signaling pathways directly causes numbers of cardiovascular diseases. NO donors plays a "double-edged sword" role in the treatment of cardiovascular diseases. When high concentration of exogenous NO presents, NO is no longer binding sGC specifically. It can react with superoxide radicals generating superoxide anion which can attack other biological macromolecules directly, causing tissue damage and affecting the normal function of the organisms. Thus, exploring the RNO (non-radical) molecules which act on the heme of sGC to regulate its activity have important physiological scientific significance and potential value in cardiovascular disease drug development..In this project, based on the fact that nitrosoalkanes (RNO) with neutral alkyl chain have the ability to bind to the heme group of sGC and weakly activate the enzyme, we intend to discover the non-radical RNO compounds which have the ability to regulate NO-sGC-cGMP signaling pathways and reveal the mechanism of sGC activation by RNO using theoretical calculations and experiments (molecular structure and energy analysis, enzyme activity and kinetic analysis, molecular cell biology and animal experiments). The purpose of the project is to discover the relationship between different alkyl chain (neutral, positively charged and negatively charged) of RNO and sGC activity, facilitate the development of the new treatment of the pulmonary hypertension disease diseases.

NO-sGC-cGMP信号通路的失调与诸多心血管疾病的发生相关。当外源NO高浓度存在时，它与超氧自由基反应转化为超氧阴离子，直接进攻其它生物大分子，造成组织损伤影响生物体正常功能。.因而，探寻作用于sGC血红素中心并调控sGC活性的RNO（非自由基）分子的结构特征及作用机制具有重要生理学意义和潜在的心血管疾病药物开发价值。.本项目，我们从中性烷基化NO结合到血红素上，调节sGC活性的基础出发，通过虚拟筛选与设计、分子结构分析、酶活分析、细胞生物学和活体动物实验的研究，明晰不同性质RNO与sGC血红素结构域的结合方式及对sGC的激活规律，阐明RNO对sGC调控作用的规律特征（电荷特征和结构特征）和分子机制，以发掘具有不同性质的R基（中性、正电性、负电性）的RNO类化合物，为以sGC为靶标的RNO类药物发现和设计奠定基础。

可溶性鸟苷酸环化酶（sGC）是一氧化氮（NO）- 环鸟苷酸（cGMP）通路中关键的信号转导酶，气体信号分子感受的血红素锚定于β亚基的N末端区域，NO等信号分子作用于其，开启NO/sGC/cGMP信号通路。如果通路失调将导致诸多心血管及其相关疾病的发生。RNO作为非自由基分子，可以与卟啉配位，在一定程度上调节酶的活性，但对R基对酶活性影响的了解处于未知阶段，更鲜有细胞和动物水平的研究报道。项目实施中（1）利用我们构建的 sGC 血红素结构域同源模型，通过计算生物学手段缩小了RNO 的筛选的实验研究范围。（2）RNO 对 sGC 激活性质的研究中，我们表达了相应的蛋白片段和从动物脏器中提取sGC 并测活，研究了RNO对sGC 的激活效率和酶反应动力学参数测定。（3）RNO 与 sGC 血红素作用的光谱学研究中初步研究 RNO 与血红素结合的配位状态。并用修饰的具有特殊性质的卟啉替代蛋白中原 有的天然卟啉实现血红素辅基的替换，研究小分子配位情况下卟啉侧链基团与 蛋白之间的信息传递和蛋白结构的影响。（4）在细胞培养体系中加入适宜浓 度的 RNO（拓展到H2S），检测蛋白表达水平以及酶活力的变化及NO/sGC/cGMP通路相关的组织病理学和一些血清学变化。总之，基本上阐明了激活sGC并调控NO/cGMP通路的RNO小分子的结构特征（受电荷和空间位置影响，不是简单的扩散的调节部位而是有一定的通道效应，类似于一氧化碳配位以六配位的形式，通过拉断组氨酸与卟啉铁的配位实现激活过程，并论述了对相关代谢路径的作用）。项目历练一支具有学科交叉特色、有国际合作能力的科研团队，在SCI杂志上发表多篇高水平学术论文。项目的完成，对以 NO/sGC/cGMP 通路相关的肺动脉高压及慢性阻塞性肺病新治疗手段的发现和发展有重要意义。