常山酮逆转放射治疗所导致的肺癌细胞上皮间质转化的分子机制研究

Radiation therapy may lead to increased expression of transforming growth factor β1 (TGF-β1), which may cause the epithelial-mesenchymal transition (EMT). This process may result in radio-resistance and the enhanced invasiveness and metastasis potency of survival tumor cells. Our preliminary study found that halofuginone could inhibit the transduction of TGF-β1 pathway, improve the anti-tumor effect of radiaton therapy, and reduce the lung and liver metastases. In this protocol, we will evaluate the impact of halofuginone on the change of TGF-β1 pathway, the EMT process and the cancer stem-like cell transition caused by irradiation to Lewis lung cancer cells in vitro and in vivo with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western Blot, and RT-PCR. And we will evaluate its impact on the apoptosis, proliferation and the invasive and metastasis potency of the tumor cells after irradiation with immunofluorescence technique, colony-forming unit assay and transwell assay. The impact of halofuginone on radiosensitivity and the metastasis potency of the tumor after irradiation will also be evaluated. The molecular mechanisms of halofuginone enhancing the radiation effect on lung cancer cells will be established and the theoretic foundation and experimental basis will be provided for the future application of halofuginone to the treatment of lung cancer, which has great theory importance and clinical significance.

放射治疗会使肿瘤组织转化生长因子β1（TGF-β1）的表达升高，从而导致肿瘤细胞的上皮间质转化（EMT）及干细胞样转化，引起残存肿瘤细胞的放疗抗拒、侵袭转移潜能增加。我们前期研究发现常山酮可以阻断TGF-β1的信号传导，增强放疗疗效，减少肿瘤转移。本课题从RNA及蛋白角度，应用酶联免疫吸附（ELISA）、Western Blot、免疫荧光及RT-PCR等技术，从细胞及动物水平，检测常山酮对放疗导致的Lewis肺癌细胞TGF-β1信号传导通路变化的影响及其对肿瘤细胞EMT及干细胞样转化的影响，并应用流式细胞术、克隆试验、Transwell等技术检测常山酮对放疗后肿瘤细胞凋亡、增殖及侵袭转移能力的影响，并同时检测常山酮对肺癌动物移植瘤放疗敏感性及放疗后肝肺转移能力的影响。确定常山酮增强放射治疗疗效的作用机制，为常山酮在肺癌治疗中的应用提供理论基础和实验依据，具有重要的理论意义和临床价值。

细胞实验部分，经ELISA、免疫荧光、Western Blot检测TGF-β信号传导通路蛋白表达情况及上皮间质转化相关指标、RT-PCR检测Twist和Snail基因表达情况，细胞划痕和Transwell实验，研究证明，照射会导致LLC细胞的上皮间质转化，使细胞的侵袭转移潜能增加。这种上皮间质转化的发生与TGF-β表达的升高及信号通路的激活有关，应用常山酮可以抑制TGF-β信号通路的激活，从而逆转LLC细胞照射后的上皮间质转化，抑制肿瘤细胞的侵袭转移。动物实验部分，证实放疗可以导致移植瘤肿瘤组织TGF-β含量的升高，并且使上皮标志物E-Cadherin表达升高，间质标志物N-Cadherin、Vimentin表达降低，应用常山酮可以抑制放疗导致的TGF-β信号通路的激活，抑制上皮间质转化，增强放疗的抗肿瘤疗效，延长荷瘤小鼠生存期。.TGF-β信号通路与抗肿瘤免疫密切相关，由于我们研究证实常山酮能够抑制TGF-β1信号通路，我们推测联合应用常山酮能够对肿瘤放疗后的抗肿瘤免疫功能产生重大影响，因而增加了部分常山酮影响肿瘤放疗后抗肿瘤免疫的内容。研究结果显示，放疗导致的TGF-β信号通路的激活会影响到髓源性抑制细胞（MDSC）、细胞毒T淋巴细胞（CTL）、调节性T细胞（Treg）、肿瘤相关巨噬细胞（TAM）等的功能，从而对抗肿瘤免疫产生不利影响；应用常山酮后阻断TGF-β信号通路后可以逆转上述变化，提高抗肿瘤免疫作用，并且可以诱导产生抗肿瘤的旁观者效应。我们进一步进行了初步的临床观察，发现肺癌病人血液中TGF-β水平的高低及其治疗中的变化与病人分血液中淋巴细胞亚群的变化明显相关，并且与肿瘤的治疗疗效相关，进一步说明TGF-β水平与抗肿瘤免疫相关，并且会影响到肿瘤治疗的疗效，可以把TGF-β作为肿瘤治疗的新的靶点开发研究新型抗肿瘤新药。