鲐鱼肽对运动性疲劳致氧化应激和炎症反应的保护作用机制

Mackerel (Pneumatophorus japonicus) is a kind of low-value fish in the upper-middle area in the ocean. It widely distributed, with high productivity, richness of protein and hydrolyzation by protease can produce many bioactive peptides. How to give full play to all these good characteristics of mackerel is a problem to be addressed. Recently, with the increasing number of fatigue groups, the anti-fatigue activity of marine bioactive peptide start to gain popularity. However, since the mechanism hasn't been made clear, the application of anti-fatigue active peptides is severely limited. In our study, peptides were prepared from mackerel through enzymatic catalyzation, ultra-filtration and chromatography will be utilized for purification. For all the products of the reaction, molecular weight will be determined and amino acid profiling will be carried out. The project will evaluate the anti-fatigue effect of mackerel peptide, and discuss protection mechanism in oxidative stress and inflammation reaction caused by exercise-induced fatigue. In addition, the effect of mackerel peptide expression of TNF-α and MCP-1 will be studied on both the transcriptional and translational levels. The implementation of this project will provide fundamental basis for the exploitation and application of anti-fatigue active peptide, which will be of enormous significance for highly-effective utilization of marine organisms and for sports physiology research.

鲐鱼是海洋中上层低值鱼类，其分布广、产量大，蛋白质含量丰富，经蛋白酶水解可获得多种活性肽，提高鲐鱼资源的高值化利用一直是亟待解决的问题。近几年，随着疲劳群体的日益增加，海洋生物活性肽在缓解疲劳方面的作用引起关注，然而其作用机制尚不明确，限制了抗疲劳活性肽的应用。本项目以鲐鱼为研究对象，采用酶解技术制备鲐鱼肽，经超滤、色谱层析等技术分离纯化鲐鱼肽并确定其分子量和氨基酸组成和序列；评价鲐鱼肽的抗疲劳活性，探讨鲐鱼肽对运动性疲劳致氧化应激和炎症反应的保护作用机制；并从分子水平研究鲐鱼肽对促炎因子TNF-α和MCP-1蛋白和基因表达的调控作用。本项目的实施将为抗疲劳活性肽的开发提供理论基础，对海洋生物资源高值化利用和运动性生理研究意义重大。

本项目以海洋中低值鱼鲐鱼为研究对象，依次选用胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶和中性蛋白酶水解鲐鱼蛋白，以水解度、氮素回收率和细胞抗氧化活性为响应值，确定最佳用酶为中性蛋白酶。采用单因素实验，对酶解反应的五个因素：加酶量、酶解时间、酶解温度、pH值和液固比进行分析，依次以氮素回收率，羟自由基清除能力，DPPH自由基清除能力和细胞抗氧化活性为响应值，确定最佳单因素条件，在此基础上，进行响应面分析实验，确定鲐鱼肽的最佳酶解制备工艺：加酶量为1203.2 U/g，酶解时间为4.53 h，pH为7.26，液固比为5.22，酶解温度为43.72 ℃。采用截留分子量为3500 Da和10000 Da的超滤膜分离鲐鱼肽，最终确定分子量小于3500Da的鲐鱼肽组分MPH-III为下一步的实验对象。采用凝胶色谱 Sephadex G25分离目标鲐鱼肽MPH-III，得到五个组分，其中组分2，即MPH-III-2的细胞抗氧化活性最高；继续选用反相高效液相色谱XBridge® peptide BEH C18分离目标鲐鱼肽MPH-III-2，得到六个组分，其中组分6，即MPH-III-2-6的细胞抗氧化活性最高。采用质谱仪Thermo Scientific Q Exactive对鲐鱼肽MPH-III-2-6进行在线检测及检索，获得两个得分较高的肽段，分别为七肽Leu-Asp-Ile-Gln-Lys-Glu-Val（分子量为843.5 Da）和八肽Thr-Ala-Ala-Ile-Val-Asn-Thr-Ala（分子量为759.4 Da）。本项目进一步研究了鲐鱼活性肽对小鼠的抗疲劳作用。实验设空白组，阴性对照组，阳性对照组，鲐鱼肽低、中、高剂量组，研究发现：各组间小鼠体重和脏器系数无显著差异，与阴性对照组相比，牡蛎活性肽剂量组能够显著延长小鼠力竭游泳时间，提高肝糖原含量，降低血尿素氮、乳酸脱氢酶和肌酸激酶的水平，提高抗氧化物酶系活力，此外，鲐鱼活性肽剂量组能够显著降低小鼠游泳产生的氧化应激反应，降低促炎因子水平，缓解炎症反应。与阴性对照组相比，鲐鱼活性肽剂量组小鼠肝脏组织中TNF-α和MCP-1基因及蛋白表达水平增加。综上所述，鲐鱼活性肽具有抗疲劳功效，且其抗疲劳作用机理与小鼠体内氧化应激和炎症反应存在相关性，这一结论为鲐鱼的高值化利用和开发提供了新思路。