江西东乡普通野生稻芽期耐冷QTL qLTT1的克隆及功能鉴定

Common wild rice (Oryza rufipogon Griff.), the wild progenitor of Asian cultivated rice (O. sativa L.), carries many agronomically beneficial alleles which were lost or weakened during rice domestication. Using a set of introgression lines (ILs), derived from a cross between Dongxiang common wild rice and an indica cultivar 93-11, we have identified a major quantitative trait locus qLTT1 on chromosome 1, associating with low temperature tolerance at early seedling stage in Dongxiang common wild rice, and obtained a low temperature tolerant introgression line NID2 which harbored the O. rufipogon-derived qLTT1 allele. Using the secondary F2 population derived from the backcross between introgression line NID2 and the recipient parent 93-11, the QTL qLTT1 was narrowed down an interval from the markers RM1244 and RM3403 on chromosome 1. Based on the previous results, a large segregation population will be developed for fine-mapping the low temperature tolerance-related QTL qLTT1 from common wild rice. At the same time, the candidate gene of qLTT1 will be obtained through the strategy of combining QTL location, global expression profile, and bioinformatics analysis. Based on the annotation of candidate gene, the gene function and its regulatory pathway involved in cold tolerance will be analyzed using molecular biology approaches. The results in this study will provide a new genetic resource for improving cold tolerance at early seedling stage in rice breeding, and also provide new insights into the molecular mechanism underlying low temperature tolerance in rice.

普通野生稻是亚洲栽培稻的野生祖先种，携带许多在栽培稻中已丢失或削弱的优异遗传基因。申请者所在课题组以优良籼稻品种93-11为轮回亲本构建的江西东乡野生稻渗入系为材料，通过芽期耐冷性鉴定，在第1染色体上定位了一个来自野生稻的耐冷QTL（qLTT1），并筛选出一个耐冷渗入系NID2。进一步利用该渗入系与93-11回交构建分离群体，将qLTT1限定在分子标记RM1244和RM3403之间。本项目将在此基础上，继续扩大分离群体，对耐冷QTL进行精细定位；同时结合QTL定位、RNA-seq表达谱分析以及生物信息学的方法确定qLTT1候选基因；利用多种分子生物学技术验证基因功能，初步构建其参与的水稻低温胁迫响应的遗传调控网络。研究结果不仅将为水稻芽期耐冷性分子育种提供新基因，而且将为揭示水稻耐冷性调控机理提供重要参考。

随着水稻直播技术的广泛应用，芽期低温已成为影响水稻生产的主要非生物胁迫因素之一。芽期低温胁迫将迟滞水稻幼苗的生长，进而影响出苗的整齐度以及最终的产量。因此，鉴定水稻芽期耐冷基因并利用分子育种技术培育芽期耐冷新品种具有重要的意义。该课题以野栽渗入系为材料，结合前期耐冷QTL定位以及全基因组表达谱分析的结果，在耐冷QTL qCTS10定位区间内获得了一个候选基因OsLTPL159。该基因编码一个定位于细胞膜的非特异性脂质转移蛋白。遗传转化实验证明，在粳稻品种中花17和籼稻品种特青中，过量表达来自耐冷渗入系IL112的OsLTPL159 等位基因可显著增强芽期耐冷性，而通过RNA干扰下调粳稻品种中花17中OsLTPL159 的表达量，则显著降低芽期耐冷性。进一步的转录组学、生理学和组织学分析表明，来自耐冷渗入系的OsLTPL159 等位基因可能通过降低活性氧的毒性作用，增强细胞壁中纤维素的沉积以及促进渗透调节物质积累，进而保持叶绿体的完整性，提高水稻芽期的耐冷性。但过量表达来自籼稻品种桂朝2号的OsLTPL159 等位基因，并没有显著改善水稻芽期耐冷性，表明在籼稻品种桂朝2号中，OsLTPL159 编码区的变异可能影响了其基因功能。进一步的序列比较发现，水稻籼粳亚种间OsLTPL159 基因的变异可能与其芽期耐冷性差异有关。因此，在水稻育种中，可利用来自粳稻品种的OsLTPL159 等位基因进一步提高籼稻品种的芽期耐冷性。另外，在前期定位的基础上，精细定位了耐冷主效QTL qLTT1-1，将其限定在94.8 kb的区间内，该区间共有14个候选基因。随后，结合表达谱分析、基因注释和基因组序列比较，对定位区域内基因进行了候选，获得2个在渗入系和9311间存在基因组序列差异的冷诱导候选基因LTT1-1G和LTT1-1M，并对其分别进行转基因验证，初步结果表明来自野生稻的LTT1-1G等位基因下调表达会降低水稻芽期耐冷性。研究结果将不仅为利用分子育种技术培育水稻耐冷新品种提供新的种质资源，而且对于揭示水稻耐冷性的分子机理提供重要参考。