大环内酯类药物调控Keap1-Nrf2通路修复气道上皮屏障损伤的作用及机制研究

The dysfunction of airway epithelial barrier plays a crucial role in the occurrence and development of COPD. The restoration of airway epithelial barrier has become a research hotspot to identify the effective drug therapy. It is known that macrolides (MA), as an anti-infective drug recommended by GOLD, shows antioxidant, anti-inflammatory and other pharmacological effects. We speculated that MA may restore airway epithelial barrier dysfunction by alleviating oxidative stress. Our study found that 14-and 15-membered MA could restore airway epithelial barrier dysfunction impaired by cigarette smoke and MA also showed potential effects on oxidative stress-related Keap1-Nrf2 signaling pathway. However, whether MA regulates airway epithelial barrier dysfunction through the Keap1-Nrf2 pathway remains to be further studied. In this study, the techniques of air-liquid interface culture, transepithelial resistance test, gene interference, molecular docking and site-directed mutagenesis were used (1) to explore the protective effects of MA on airway epithelial barrier dysfunction induced by cigarette smoke from cell models to animal models; (2) to determine the mediated mechanism of Keap1-Nrf2 pathway in regulating airway epithelial barrier dysfunction by MA; and (3) to reveal the interaction mode between MA and target proteins related to Keap1-Nrf2 pathway. Our study aims to broaden the extrabacterial pharmacological effect and clinical application of MA, which will provide research basis and innovative theory for COPD treatment.

气道上皮屏障损伤是COPD发生发展的重要因素，基于修复气道上皮屏障寻找有效的药物治疗手段已成为当下的研究热点。已知作为COPD全球倡议推荐的抗感染用药，大环内酯类药物（MA）亦具有抗氧化、抗炎等药理作用，推测其可能通过对抗氧化应激修复气道上皮屏障。我们的研究初步证实，14、15元环MA可改善香烟烟雾所致的气道上皮屏障损伤，且对氧化应激的关键通路Keap1-Nrf2具有潜在的调控作用。然而MA是否通过调控Keap1-Nrf2通路修复气道上皮屏障有待深入研究。本研究运用气液界面培养、跨上皮电阻实验、基因干扰、分子对接及定点突变等技术，①从细胞模型到动物模型，系统性探讨MA对气道上皮屏障损伤的修复作用；②明确Keap1-Nrf2通路在该修复作用中的介导机制；③揭示MA与Keap1-Nrf2通路相关靶蛋白的相互作用模式。本研究旨在拓展MA的抗菌外药理作用和临床应用价值，为COPD治疗提供创新理论。

气道上皮屏障是呼吸道抵御环境侵害的第一道防线，香烟烟雾（CS）诱导的氧化应激可导致气道上皮屏障的结构与功能异常，是慢阻肺（COPD）进展的初始步骤和病理基础。基于修复气道上皮屏障寻找有效的药物治疗策略已成为近年的研究热点。本项目基于前期研究和前人报道提出：14、15元环MA可能通过激活Keap1-Nrf2通路修复CS诱导的气道上皮屏障损伤。. 为证实该假设，本项目首先使用体内和体外吸烟模型研究了MA对气道上皮屏障的保护作用。在符合伦理和知情同意的基础上，提取了受试者来源的人原代支气管上皮细胞（PBECs）体外培养，对其进行MA预处理及香烟烟雾提取物（CSE）孵育，亦采用SD大鼠的COPD模型进行MA预防用药的体内实验。通过检测跨上皮电阻、胞间连接蛋白、促炎因子和凋亡水平，评估上皮屏障损伤程度。研究发现14、15元环MA（阿奇霉素AZI、红霉素EI）可呈剂量依赖性地对CS诱导的气道上皮屏障损伤起保护作用，而16元环MA（螺旋霉素）无此作用。随后我们发现AZI和EI可剂量依赖性地逆转CS引起的Nrf2下调，而对Keap1无明显影响。此外，Nrf2激动剂TBHQ和抗氧化剂维生素C对气道上皮屏障损伤也有类似AZI的影响。表面等离子体共振实验发现MA与Keap1、Nrf2无直接相互作用。进一步地，本研究采用基于LC-MS的代谢组学方法获得体内模型的代谢谱，发现GSH代谢通路是该过程中最受影响的关键通路，AZI处理上调了谷氨酰半胱氨酸连接酶（GCL）活性和GSH代谢通路中代谢产物的含量。本研究通过构建Nrf2敲减的人支气管上皮细胞株（HBECs）和Nrf2敲除的C57BL/6N小鼠，发现Nrf2的缺失加剧了CS诱导的气道上皮屏障损伤，且该失衡无法被AZI所逆转。证实了Nrf2/GCL/GSH通路在AZI修复气道上皮屏障中的介导作用。. 本研究使用人原代细胞和细胞株、大鼠和转基因小鼠等多种成熟模型，证实了14、15元环MA对COPD气道上皮屏障损伤的保护作用，并揭示了Nrf2/GCL/GSH通路在该过程中的关键介导作用。本课题的顺利完成，拓展了关于MA的抗菌外药理作用和临床应用价值，为优化COPD的治疗策略提供理论依据、为大环内酯类新药的研发提供实验证据。