Ca2+和cAMP信号通路的双向性调节在卵母细胞体外成熟中的作用机制

前期研究发现提高卵浆内cAMP抑制减数分裂24小时后，卵母细胞中存在其它信号通路促进线粒体活性增强，逆转cAMP抑制减数分裂的作用，继续抑制卵浆内cAMP降低，可触发线粒体信号途径导致凋亡发生，针对Ca2+作为卵母细胞内信使物质，其浓度波动与细胞周期变化和凋亡密切相关，提示提高胞内cAMP能促进Ca2+信号通路的成熟，因此我们提出Ca2+和cAMP这两条信号通路双向性调节卵母细胞成熟能力获得的工作假说。本项目将探讨cAMP是否促进质膜上Ca2+通道、IP3-受体等表达，使卵母细胞膜Ca2+内流增加，钙震荡形成，降低AC活性，导致生成cAMP减少，下游PKA酶活性下降，卵母细胞和卵丘颗粒细胞间的缝隙连接丧失，使卵母细胞内cAMP进一步减少，促发自发成熟。为进一步阐明人类卵母细胞的发育机制和非整倍体形成机理，cAMP类可逆性核成熟抑制剂应用于IVM序贯培养提供充分的依据。

在获得国家自然科学基金的资助以后,课题的进展基本按照计划进行。第一阶段重点是进行小鼠的动物实验，先检测了小鼠窦卵泡不同发育阶段卵母细胞中cAMP、Ca2+水平和震荡模式，及其相关调控蛋白的时空变化情况。发现在体外自发成熟和体内成熟中cAMP水平、磷酸二酯酶3A（PDE3A）、环磷酸腺苷合成酶（AC）、PKA mRNA的变化模式完全不同。同时证实卵母细胞中Ca2+的浓度升高主要通过两种机制，一种是细胞内钙库中Ca2+释放，另一种是外源Ca2+通过质膜Ca2+通道流入卵母细胞中。在卵母细胞成熟前的优势卵泡中，质膜Ca2+通道蛋白的mRNA的表达显著增多，而IP3R的mRNA的表达无这种变化，而在HCG后，伴随着胞浆内cAMP合成增多 而显著增加，在卵母细胞成熟中IP3受体逐渐增多。人卵体外成熟实验研究，发现肝素能显著影响卵子的减数分裂及发育潜能，可能与肝素是IP3受体抑制剂有关，其可能阻止减数分裂的恢复和MPF及MAPK的激活，为此我们进行了小鼠实验以进一步证实并探讨其具体机制。肝素呈剂量依赖性抑制小鼠卵GVBD的发生，并且在高cAMP水平条件下影响更大。采用Forskolin提高COCs及卵子中cAMP水平，可以提高线粒体的膜极性，增加ATP合成。而肝素抑制线粒体的膜极性，尤其是在高cAMP水平条件下抑制效果显著增强，说明Ca2+在卵子减数分裂中起了关键调控作用，干扰其能抑制减速分裂发生。第二阶段的研究探讨提加卵浆中Ca2+水平对卵母细胞钙震荡模式的影响，及其对cAMP水平及震荡模式的影响及作用机制。研究显示卵母细胞内Ca2+增加能刺激成熟分裂阻滞的卵子发生GVBD，用Ca2+载体（A23187）处理卵母细胞，或增加Ca2+浓度可以逆转dbcAMP对自发性成熟的抑制作用，同时能刺激卵泡包被的卵母细胞成熟。LH对卵泡包被的小鼠卵母细胞成熟的促进，有赖于外部Ca2+的浓度。细胞外的Ca2+螯合剂或Ca2+摄入抑制剂能阻止卵母细胞的自发性成熟。在卵母细胞体内和体外成熟中前期的卵子和卵丘颗粒细胞的cAMP峰起了关键作用，促进卵母细胞内Ca2+储备，GVBD前的Ca2+震荡峰增加，促进了MII期卵母细胞纺锤体的正常形成和染色体分离。针对临床难以获得大量人卵进行基础研究，牛卵的生理特点与人卵非常接近，以牛卵的实验模型进行验证，得到了类似的实验结果。