HdiR-like蛋白调控猪链球菌耐药相关ICEs水平传播的分子机制

Integrative conjugative elements (ICEs) are major vectors for horizontal transfer of antibiotic resistance genes which is widespread in bacteria including Streptococcus suis. Previous reports show that LexA- or HdiR-dependent SOS responses can activate the transfer of ICEs in some bacterium species. But little is known about how Streptococcus suis which lacks LexA-like repressor (HdiR) trigger the horizontal transfer of ICEs. Now we identified a HdiR-like protein in ICESa2603 family ICEs which had a high expression level responsed to DNA damage. Based on our preliminary data we generated the hypothesis that HdiR-like protein involves in the transfer of ICEs. To approve the hypothesis we will (1) evaluate the sensitivity of HdiR-like to a variety of exogenous and endogenous stresses; (2) analyze DNA binding and self-cleavage function of HdiR-like using recombinant protein; and (3) study the ways of HdiR-like regulated the horizontal transfer of ICEs in response to DNA damage. The study will answer the question whether and how ICEs transfer in response to DNA damage, and to provide a theoretical basis for the development of drugs targeting horizontal gene transfer.

整合接合元件（ICEs）是介导细菌耐药基因水平传播的重要载体，在猪链球菌中广泛存在。研究显示部分细菌可通过LexA或HdiR依赖的SOS应答系统调控ICEs转移，但猪链球菌缺少该应答系统，其ICEs转移调控机制尚属未知。申请者前期研究显示ICESa2603家族ICEs可表达类似HdiR的蛋白（HdiR-like），并证实其在DNA损伤导致ICEs剪切环化过程中呈高表达，推测其参与ICEs的转移调控。本项目拟采用基因敲除、定点突变、EMSA、Chip-Seq等技术，进一步通过鉴定激活ICEs转移的各类DNA损伤压力、验证HdiR-like的DNA结合和自我切割功能，重点阐明缺少HdiR依赖的SOS应答系统的猪链球菌如何通过HdiR-like感受DNA损伤进而调控ICEs水平转移这个科学问题。该项目的完成对控制猪链球菌耐药性水平传播具有深远意义，并为开发抗基因水平转移药物的研究提供理论基础。

整合性接合元件（ICEs）是整个链球菌属中重要的耐药相关可移动遗传元件，能携带多种重要抗生素耐药基因，在链球菌耐药基因传播中的重要作用。研究显示部分细菌可通过LexA或HdiR依赖的SOS应答系统感受DNA损伤促进ICEs转移，但猪链球菌缺少该应答系统，其转移调控机制尚属未知。本项目基于前期耐药相关基因组研究策略，发现并鉴定了一类新的编码HdiR-like（HdiR-I）的ICESsuYZDH1家族，其编码三个丝氨酸整合酶，可整合到SSU0877、SSU0468、SSU1262和SSU1797四个位点。ICESsuYZDH1能进行切除环化和水平转移，介导Tet-MLS类耐药基因在猪链球菌中广泛分布和传播。通过对诱导ICESsuYZDH1切除环化和接合转移的各类选择压力（包括各类抗生素、氧化试剂等）进行筛选，发现丝裂霉素C、环丙沙星和过氧化氢等DNA损伤能否诱导ICESsuYZDH1切除环化和接合转移；进一步转录组分析和qPCR证实丝裂霉素C诱导的DNA损伤过程中伴随着hdiR-I的极显著上调，提示HdiR-I可能在丝裂霉素C诱导的DNA损伤应答中起到重要作用。通过构建rHdiR-I和rHdiR-I/A115D原核重组表达质粒，蛋白经表达纯化后，进行EMSA试验证实rHdiR-I具有结合自身启动子的生物学功能，通过不同长度启动子结合试验筛选出rHdiR-I的结合特征序列为TTTTGTTAGTTTATAAAACAACAAAA。进一步通过不同pH的自我切割试验证实在高pH条件下rHdiR-I能进自我切割，其切割位点为A115D。综合上述研究成果，进一步探究了胁迫条件诱导HdiR-I应答，激活ICE环化切除，进而调控ICE水平转移的分子机制。该研究系统研究了在缺少经典SOS系统的猪链球菌中ICEs如何响应DNA损伤调控自身水平转移的分子机制，研究成果完善了细菌可移动遗传元件水平转移机制的研究理论，有助于我们探索延缓细菌耐药性水平传播的途径，也为抗基因水平转移药物的开发提供了理论依据。