基于肿瘤细胞代谢的NQO1底物抗肿瘤作用的分子机制研究

Accumulating evidence suggests that NAD(P)H quinone oxidoreductase 1 (NQO1) is a promising therapeutic target for cancers. Its substrates have been identified as promising agents for various cancer therapy, which exhibited in an NQO1 dependent manner on DNA damage and inducing apoptosis. However, the molecular mechanism of NQO1 substrates anti-tumor activity remains to be explored. Our previous studies found that the typical NQO1 substrate β-lapachone could significantly change the metabolomic profile in drug sensitive non-small lung cancer cell line A549 including decreased production of pyruvate and lactate. Beside, the supplementation of pyruvate could obviously reverse β-lapachone induced cell cytotoxicity. These findings prompted us to hypothesize that: NQO1 substrates regulate the metabolic phenotype of cancer cells and the metabolic shifts are involved in initiation of apoptosis. Therefore, this project aims to explore the underlying mechanism of chemotherapy drugs from the effects on biohomeostasis with the combined approaches of metabolomics and molecular biological technology. Results obtained from this study will not only shed light on optimizing the strategy to design NQO1 target quinones, but also be used to identify targets for new anticancer strategies.

NAD(P)H:醌氧化还原酶1（NQO1）作为一个潜在的抗肿瘤药物靶点，其底物被广泛证明具有确切的抗肿瘤活性，表现为NQO1依赖的DNA损伤、诱导细胞凋亡等特征，但目前关于NQO1底物抗肿瘤活性的分子机制仍不清楚。本项目前期研究发现NQO1底物β-拉帕醌短时间刺激即可显著影响A549细胞的代谢，其中糖酵解末端产物丙酮酸和乳酸的含量明显降低；此外，在培养基中添加丙酮酸可显著逆转β-拉帕醌的细胞毒作用。且这种迅速发生的代谢扰动优先于凋亡发生过程的启动。基于此提出假说：NQO1底物通过改变肿瘤细胞的代谢模式，影响代谢中间产物的含量，进而启动细胞凋亡程序，发挥抗肿瘤作用。因此，本项目拟结合代谢组学和分子生物学技术，从化疗药物对生化代谢影响这个角度深入探索其抗肿瘤作用的内在机制，为靶向NQO1的醌类抗肿瘤药物研发提供科学理论依据，为寻找新的抗肿瘤靶点提供线索和依据。

本部分内容拟从代谢调节这个全新的角度来阐明NQO1介导的β-拉帕醌生物活化及分子调控机制。基于LCMS-Q-TOF和GC-MS技术的细胞代谢组学研究方法发现：β-拉帕醌刺激可显著地改变A549细胞的代谢模式，β-拉帕醌影响了A549细胞的多条代谢通路，主要包括抑制糖酵解途径和三羧酸循环，并增强磷酸戊糖途径。同位素示踪实验（1,6-13C2-葡萄糖作为示踪剂）进一步证实了上述代谢通路分析结果，并初步提示PKM2催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸的代谢环节是β-拉帕醌的关键调控节点。通过qRT-PCR检测糖代谢通路中关键酶或转运体的表达发现，β-拉帕醌对PKM2基因表达无明显影响。酶活性分析发现β-拉帕醌可时间依赖性地抑制细胞内PKM2丙酮酸激酶活性。此外，NQO1特异性抑制剂双香豆素/N-乙酰半胱氨酸能显著逆转β-拉帕醌诱导的PKM2活性下降，提示β-拉帕醌能引起NQO1依赖ROS介导的PKM2活性下降。为了揭示β-拉帕醌的抗肿瘤效应与PKM2活性抑制之间的关系，进一步通过变构激活、变构抑制和PKM2基因瞬时沉默手段干预A549细胞内PKM2的活性，考察其对β-拉帕醌细胞毒作用的影响。研究结果显示：PKM2变构激活剂TEPP-46可显著逆转β-拉帕醌的凋亡诱导作用；PKM2抑制剂和基因沉默则进一步增加β-拉帕醌的细胞毒作用；培养基中补充PKM2下游产物丙酮酸可显著逆转β-拉帕醌的凋亡诱导作用。以上结果提示PKM2活性抑制是β-拉帕醌诱导肿瘤细胞凋亡的关键分子机制。. 进一步研究发现，短时间内，丙酮酸不能抑制β-拉帕醌“还原-自氧化-还原”循环过程中ROS的产生或作为抗氧化剂清除ROS，同时对细胞内NAD+水平无明显影响但可逆转β-拉帕醌所引起的NAD+耗竭。谷氨酰胺和柠檬酸的补给实验也排除了丙酮酸通过线粒体途径拮抗β-拉帕醌的凋亡诱导作用。前期研究结果表明，NQO1依赖的SIRT1-FOXO1凋亡信号通路是β-拉帕醌发挥抗肿瘤活性的关键分子机制之一，我们的研究发现丙酮酸能抑制 SIRT1-FOXO1 凋亡信号通路。综上所述，本部分内容揭示了 β-拉帕醌通过抑制 PKM2 活性，使细胞内 6-磷酸葡萄糖蓄积，增强磷酸戊糖通路，降低丙酮酸水平，诱导SIRT1-FOXO1 凋亡信号通路，进而促进细胞凋亡。