蛋壳特异基质蛋白质OC-17表达调控网络构建及其对碳酸钙结晶作用的分子机理研究

Eggshell quality improvement is one of the major breeding aims in poultry breeding. Eggshell matrix protein mainly affect eggshell quality via controlling and regulating the deposition of calcium carbonate in the calcified eggshell layer. Ovocleidin-17(OC-17) was the first eggshell-specific matrix protein to be isolated and characterized following its chromatographic purification after eggshell decalcification. OC-17 was also the first protein directly involved in the non-pathological biomineralization process resolved by x-ray diffraction. Genomic sequences of OC-17 were still unknown up to now because of the very high GC content. This study would utilize BAC fishing, long range PCR and other technologies to elucidate gene structure of OC-17. DNA FISH technology would be used to map OC-17 on chicken chromosome. Gene expression changes would be monitored in the cell lines via gene overexpression, inhibition of OC-17 in the chicken uterus tubular cell lines and transcriptomes in the different development stages and laying stages in the uterus. We would construct gene co-expression network based on the gene expression profiles. There are 6 amino acids and 2 structure domains which were predicted to interact specifically with calcium ions. We would introduce point mutation for these sites separately and express recombinant OC-17 proteins in 293T cell lines. The purified recombinant proteins would be used to study potential effects of candidate amino acids on the calcium carbonate deposition and crystal growth in vitro. Results of this study would be important for explaining mechanism of OC-17 on the calcium carbonate deposition and also would be helpful for eggshell quality improvement.

提高蛋壳质量是家禽育种的一个主要育种目标。蛋壳基质蛋白质对蛋壳质量有重要影响。OC-17蛋白质是第一个被分离、也是唯一晶体结构被解析的蛋壳特异基质蛋白质。由于高度富含GC，在鸡参考基因组中没有被组装成功，也不能开展OC-17蛋白质对碳酸钙结晶作用机理以及表达调控网络研究。本研究在我们已获得cDNA全长序列基础上，利用钓BAC文库、DNA-FISH等技术手段来阐明OC-17基因结构、定位基因到鸡染色体。通过基因过表达、表达抑制试验以及不同发育与产蛋阶段的子宫部组织表达谱变化规律，构建OC-17表达调控网络。对预测的6个钙离子结合位点以及两个结构域进行定点突变，在293T细胞中表达重组蛋白。在体外钙化模型中研究突变重组蛋白质对碳酸钙沉积速度与晶体形成的影响，确认结合钙离子的氨基酸位点或者结构域。研究成果将有助于阐明蛋壳形成机制与生物钙化机制，对蛋品质改良也将有重要应用价值。

畜禽重要经济性状改良是动物育种工作的主要目标。蛋壳质量具有重要经济价值，是家禽育种至关重要的选种指标之一。本研究围绕蛋壳形成机制，开展了蛋壳基质蛋白 Ovocleidin-17(OC-17)与碳酸钙作用机制的研究，通过转录组以及蛋白组的手段鉴定蛋鸡形成过程中的关键基因，为蛋清和蛋壳质量的改良提供新的思路。 .基于此前预测的 OC-17 可能的与碳酸钙的作用结合位点，我们设计了4种OC-17 的突变型，在哺乳动物细胞 HEK-293T中对OC-17野生型和突变型蛋白进行重组表达并纯化。在体外碳酸钙结晶实验中添加不同类型的重组蛋白，研究蛋白在碳酸钙结晶过程中的作用模式。结果表明: (1)野生型 OC-17可以促进方解石晶体的快速形成，同时降低晶体的大小。(2)丝氨酸 61 缺失突变型蛋白对方解石晶体的作用效力不如野生型; (3)丙氨酸替换突变型 M1−M3 可以在一定程度上促进晶体的生长。因此，本研究通过实验的方法确认了 OC-17 与碳酸钙晶体表面结合的 4 个重要结构域。 我们通过试验分析了鸡蛋形成过程中鸡卵巢和输卵管的三个部分（膨大部、峡部和子宫）的转录组。获得了8365条长度大于200bp的新转录本，其中6832个是lncRNA。我们在膨大部（蛋白分泌组对比不分泌组）和子宫部（蛋壳钙化组对比非钙化组）中分别鉴定了547个差异表达基因和585个差异表达基因。结合QTL、转录组和蛋白质组数据，我们获得了高质量的影响鸡蛋形成的基因列表。通过蛋白质组和转录组相互结合的方式，鉴定鸭蛋壳中的蛋白质组成，同时比较产蛋前16小时和成熟鸭蛋壳蛋白质组的差异。我们在成熟的鸭蛋蛋壳中一共检测到484种蛋白。通过比较鸭蛋壳与鸡、鹌鹑、火鸡的蛋壳，我们发现有64种蛋白在四种鸟类的蛋壳中均有表达。另外，通过蛋白质组的差异性检验结果表明蛋壳矿化过程中一共有54个蛋白差异表达。此研究首次通过多组学整合的手段鉴定出鸭蛋蛋壳蛋白质组成。成功获得了OC-17的基因组序列（鸭）并获得完整的基因组结构，通过表达谱数据、蛋白互作数据，构建了OC-17蛋白质互作图。.通过本研究，首次获得了禽类CTL的基因组参考序列，并构建了相关表达调控网络，开展了突变位点研究，弥补了蛋壳形成研究领域的最基础一个环节，为阐明蛋壳形成机理打下了坚实的基础。