Microbulbifer属细菌的对羟基苯甲酸和酯类合成调控机制研究

Marine bacterium, Microbulbifer sp. A4B-17 produces various secondary metabolites such as 4-hydroxybenzoate (4HBA) and esters of 4HBA (parabens). 4HBA is a useful material for the synthesis of the liquid crystal. On the other hand, parabens are man-made compounds that have been extensively used since the 1920s in the cosmetic, pharmaceutical, and food industries for their effective antimicrobial activity. In previous work, we completed the A4B-17 strain genome sequencing and annotation, and found all genes responsible for the 4HBA biosynthesis using glucose. Biosynthesis pathway for 4HBA involves three metabolic pathways: glycolysis pathway for conversion of glucose to phosphoenoylpyruvate and erythrose 4-phosphate; shikimate pathway for production of chorismate; 4HBA and parabens synthesis pathway. In this project, we focus on the synthetic rout from shikimate pathway to 4HBA and parabens synthesis pathway. Our main research contents in this project are to study: 1) key genes in the lower metabolic pathways; 2) the regulatory mechanisms at 3-deoxy-D-arabino-heptulosonic acid 7-phosphate synthase and chorismate lyase points; 4) the thermodynamics for carboxylesterase. In this project, we can understand the mechanisms of 4HBA biosysthesis and the regulation mechanisms, it will be a fundamental research for 4HBA biosynthesis from renewable resources.

海洋细菌Microbulbifer sp. A4B-17拥有合成对羟基苯甲酸(4HBA)和酯类等次级代谢产物的功能。4HBA是合成液晶等用途广泛的有机合成原料，4HBA酯类有抑菌活性，作为防腐剂广泛应用于食品和化妆品的保存上。在前期研究中，本课题组完成了A4B-17菌株的基因组测序和注释，预测出相关生物合成途径和基因。莽草酸途径是合成芳香族化合物的下游关键途径，文献表明在其他菌株中受到严格的反馈调控，但该菌株的状况尚不明了。本项目拟对从莽草酸途径以后的途径做深入的调控机制研究：鉴定从莽草酸途径到4HBA和酯类合成的关键基因；通过转录表达和酶活性研究阐明3-脱氧-β-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合酶和分支酸裂解酶两个关键位点的调控机制；研究酯类合成的羧酸酯酶的热动力学特征。这三部分研究对阐明下游合成代谢的调控机制具有重要意义，将为利用A4B-17菌株从可再生资源生物合成生物基化学品奠定基础。

对羟基苯甲酸(4HBA)是用途广泛的有机合成原料，主要应用于食品、化妆品、医药的防腐、防霉剂和杀菌剂的合成方面。4HBA的另外一个重要用途是在合成液晶高分子上的应用。随着电子信息化社会的不断发展，4HBA的市场需求量日益增加，现行的4HBA生产工艺是以石油成分合成而得，在环境污染的不断恶化、人类的生存已经面临威胁之际，利用可再生资源代替以石油为原料的生产工艺已成为全球当务之急。4HBA的化学结构类似于芳香族氨基酸，在理论上利用生物的芳香族氨基酸合成途径，即莽草酸途径可以合成4HBA。海洋细菌Microbulbifer sp. A4B-17天然拥有合成积累4HBA和酯类的功能，如果有效的强化合成基因，一定能够开发出一个能满足工业生产需求的4HBA合成工业微生物。基因组测序结果显示A4B-17菌株基因组大小为5,035,829 bp，共计4,604个基因。基因组功能注释后，推测出糖代谢的三条途径，糖酵解途径、ED途径、磷酸戊糖途径第一个糖酵解途径。糖酵解途径，葡萄糖在无氧条件下进行分解，经过磷酸烯醇式丙酮酸，生成丙酮酸的过程；第二个是ED途径，即6-磷酸葡萄糖经ED途径先生成丙酮酸，再经过草酰乙酸形成磷酸烯醇式丙酮酸；第三个是磷酸戊糖途径，即6-磷酸葡萄糖经磷酸戊糖途径生成4-磷酸赤藓糖。另外本研究还推测出莽草酸途径上的全部基因。莽草酸途径是合成芳香族化合物的关键途径，糖酵解途径中形成的磷酸烯醇式丙酮酸和磷酸戊糖途径生成的4-磷酸赤藓糖，可以进入莽草酸途径合成分枝酸，分枝酸在分枝酸裂解酶的催化作用下生成4HBA，4HBA在羧酸酯酶的催化下最终生成4HBA酯类物质。本研究对4HBA和酯类合成的关键酶，DAHP合酶、分支酸裂解酶和羧酸酯酶进行了基础研究，包括最适温度、最适pH等最佳反应条件，为将来的深入拓展研究奠定了基础。