新型抗菌肽MDAP-2的结构优化与高效表达

Increasingly serious pathogen resistance problems made new antibiotics substitutes research being imminent. For the unique antibacterial mechanism, no drug resistance, no immunogenicity, and does not damage animal cells, etc., antibacterial peptides have become hot issues of new drug research and development. Based on more than ten housefly antibacterial peptide genes screened by SSH techniques. Using prokaryotic expression system, we obtained a new type of antibacterial peptide MDAP-2, which have high antibacterial activity, wide antibacterial spectrum, and extremely low sequence homology with other antibacterial peptide genes. We will modify the sequence of MDAP-2 in the light of its positive and negative content, peptide chain structure, and amphiphilic features to improve its antibacterial activity. We will construct a recombinant fusion protein MDAP-2- HSARb (human serum albumin) to increase the half-life of MDAP-2 in animals. Through expressing MDAP-2- HSARb in insect baculovirus expression system to increase the expression amount of MDAP-2- HSARb recombinant fusion protein. And thus the pharmacodynamics in vivo, pharmacodynamics in vitro, and pharmacokinetic in vivo were studied. The project will lay a solid foundation for development of long-acting antibacterial peptide for animals. And it will promote the antibacterial peptides substitute for antibiotics to some extent, reduce antibiotic use, and delay the process of pathogenic bacteria drug resistance.

日趋严重的病原菌耐药性问题使得新型抗生素替代品的研发迫在眉睫。抗菌肽因具有抗菌机制独特，不易产生耐药性，且不损伤动物体细胞和无免疫原性等特点已成为新药研发的热点。课题组在采用抑制性消减杂交技术筛选获得十余个家蝇抗菌肽基因，采用原核表达系统制备与其他抗菌肽基因的核苷酸及氨基酸序列同源性极低、抗菌活性高、抗菌谱广的新型抗菌肽MDAP-2基础上，针对其正、负电荷含量、肽链结构和两亲性对其序列进行分子修饰，提高其抗菌活性；通过抗菌肽MDAP-2-人血清白蛋白重组融合蛋白的构建，增加抗菌蛋白在动物体内的半衰期；通过抗菌肽MDAP-2-人血清白蛋白重组融合蛋白昆虫杆状病毒表达系统的构建，增加重组融合蛋白表达量，进而对抗菌肽MDAP-2重组融合蛋白体内外药效学及体内药代动力学进行研究，为动物用长效抗菌肽的开发奠定坚实的基础，以推进抗菌肽在一定程度上替代抗生素，减少抗生素使用，延缓病原菌耐药性产生的进程。

日趋严重的病原菌耐药性问题使得新型抗生素替代品的研发迫在眉睫。项目组围绕抗菌肽 MDAP-2 正电荷含量、疏水性和肽链结构，对其氨基酸进行删减和替换制备改良肽，通过体外抑菌活性测定，筛选出抗菌活性高的改良肽；构建 MDAP-2改良肽-人血清白蛋白重组融合表达载体，并对原核表达的重组融合蛋白的体内外抑菌活性和半衰期进行检测；构建昆虫杆状病毒表达系统的重组转作载体pFAST-MDAP-2-HAS，将获得的重组杆状病毒穿梭载体转染昆虫草地夜蛾Sf9细胞，对昆虫杆状病毒表达表达的MDAP-2改良肽-人血清白蛋白重组融合蛋白进行体内外抑菌活性和在小鼠及靶动物体内的药代动力学参数进行测定。本项目共获得3个活性较好的改良肽，其中MB16-13.16R和MB19-5.7R对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均有抑制作用，而OM19只对革兰氏阴性菌中的大肠杆菌，沙门氏菌和志贺氏菌有抑制作用；构建了抗菌肽的原核表达体系和昆虫细胞表达系统，成功完成对改良肽OM19r的半衰期延长的设计和研究，PEG修饰后，OM19r的半衰期由70min最终延长到240min，提高了3.4倍；改良肽抗菌机制研究结果显示，改良肽MB16-13.16R和MB19-5.7R可穿透E. coli ATCC25922外膜和内膜，引起细胞外膜和内膜通透性的增加，且存在剂量依赖效应，用1×MIC浓度的MB16-13.16R和MB19-5.7R处理大肠杆菌和金黄色葡萄球菌30 min后，大肠杆菌细胞表面变粗糙，金黄色葡萄球菌细胞形态无法辨识，说明抗菌肽MB16-13.16R和MB19-5.7R具有较强的细胞膜破坏能力；改良肽OM19r对细菌细胞膜没有破坏作用，其主要作用位点为细菌核糖体，通过抑制其转录翻译来抑菌。本项目为动物用长效抗菌肽的开发奠定坚实的基础，以推进抗菌肽在一定程度上替代抗生素，减少抗生素使用，延缓病原菌耐药性产生的进程。