联合188Re和/或siRNA的适配子靶向治疗胶质瘤的实验研究

采用SELEX技术筛选出的核酸适配子（aptamer）具有与靶分子结合的高特异性和高亲和力，而且还可转运具有"基因沉默"作用的小分子干扰RNA（siRNA）。适配子具有靶向分子的基本特性，被称为"化学性抗体",并且具有易储存、易修饰、合成方便、低毒性及低免疫原性等特性，所以适配子在肿瘤诊断和治疗中的作用越来越受到重视。我们在以前的工作中用SELEX技术已筛选出针对人恶性胶质瘤特异抗原-表皮生长因子受体Ⅲ型突变体（EGFRvⅢ）的适配子。本课题拟采用针对EGFRvⅢ的核酸适配子作为靶向转运载体，分别与针与c-Met受体基因的siRNA和/或188Re标记形成复合物，探讨它们在细胞水平和荷瘤鼠上的抑瘤作用。由于适配子的分子小、特异性高等特点，可有效地降低毒副作用；将适配子介导的核素治疗和生物治疗结合起来，可提高靶向性，增强疗效。本项目可为分子靶向治疗胶质瘤提供新的途径和方法。

本课题采用细胞SELEX（cell-SELEX）方法筛选得到针对过表达胶质瘤特异靶标EGFRvIII的U87细胞（U87-EGFRvIII）的适配子（aptamers），并探讨适配子携带siRNA或188Re进行胶质瘤治疗相关研究。主要取得以下创新性成果：（1）成功建立了筛选针对U87-EGFRvIII细胞适配子的方法。采用不对称PCR法或链亲和素磁珠法分离单链DNA用于制备亚库；（2）成功建立一种测定适配子与细胞结合力的Kd值（解离常数）的方法。筛选得到的适配子与细胞结合的Kd值均在nM水平，显示很高的细胞结合力。通过细胞免疫荧光和流式细胞检测进一步证明适配子与U87-EGFRvIII细胞结合的特异性；（3）发现一些适配子在MTT实验中显示对U87-EGFRvIII细胞有抑制增殖的作用。适配子A32的靶标鉴定为EGFRvIII蛋白；（4）激光共聚焦检测发现一些适配子具有进入U87-EGFRvIII细胞的胞浆和核内的作用。我们在体外实验中发现适配子可携带c-Met siRNA进入U87-EGFRvIII细胞并产生凋亡作用，其作用与脂质体转染siRNA效果相似；（5）发现在瘤内注射188Re标记适配子时有很好地抑制体内肿瘤生长的作用，与适配子携带的c-Met siRNA有协同抑制作用。以上研究结果对于建立成功筛选cell SELEX方法和适配子特性鉴定等方面提供研究经验；对于探讨适配子作为携带siRNA、放射性核素等治疗分子的载体研究提供新的研究基础；为分子靶向治疗胶质瘤提供新的途径和方法。