一个控制水稻叶型候选基因的功能验证及分子调控机理研究

叶片是光合作用的主要器官，水稻理想株型关键点是对叶型的改良。叶片挺直、叶倾角小的叶型是水稻理想株型的主要技术指标及高产形成的基础。研究水稻叶发育和形态建成，不仅可丰富叶发育的分子机理，而且有助于水稻理想株型的形态塑造。. 本研究利用组培突变获得的一个反卷叶大叶角等多个性状具有明显差异的突变体，在前期已开展图位克隆、确定候选基因的基础上，全面细致观察突变体的农艺性状和组织显微结构差异，构建相关载体进行遗传转化，进行功能互补验证、基因表达的组织特异性、时空性和蛋白的亚细胞定位等研究。同时通过基因芯片分析、全定量RT-PCR检测验证，选择与突变性状相关的上下调基因构建RNAi或过表达载体转入到突变体中，考察转基因株系的性状变化差异，深入探索候选基因在叶形态建成上的分子调控机理，以及可能参与的其它发育调控途径，为水稻株型形态改良的分子设计育种提供有效的基因。

本研究利用组培突变获得的一个多性状具有明显差异的突变体fj开展研究。突变体fj具有叶片反卷、矮杆、无叶表皮毛和抽穗后叶片下垂等特征，矮杆类型属d6型。分别用植物激素GA3和BR不同的三种浓度水平处理突变体fj，反卷叶表型不能恢复正常。石蜡切片观察突变体fj下表皮的泡状细胞比野生型大且数目多导致叶片反卷。突变体fj第二、三节茎秆纵切面细胞长度比野生型短，第一节反而比野生型长。遗传分析突变体fj是由单基因控制的隐性突变体，通过图位克隆把FJ基因精细定位在30kb的范围内，测序分析发现一个编码水解蛋白的基因第一个内含子与第二个外显子剪切处碱基GGA变成了GAA，剪切位点前移了一个碱基，导致氨基酸发生变化。获得的该基因两个T-DNA插入系，其表型特征与突变体fj完全一致。Western Blot杂交检测突变体fj和两个T-DNA插入系，均没有检测到与野生型一致的目标蛋白条带。获得转突变体fj的转基因本身的启动子融合全长CDNA的转基因株系恢复了野生型的表型，综合实验结果进一步验证FJ基因编码了一个水解蛋白。利用半定量PCR检测FJ基因在根、茎、叶、鞘和穗中均有表达且表达没有明显的差异，FJ基因属于组成型表达基因。水稻转基因观察FJ蛋白定位在细胞膜上。采用分蘖期的叶片做基因芯片分析，结果表明四倍以上差异表达的上调基因有139个，下调了的基因有14个。在进一步定量RT-PCR验证的基础上，选择一个GA合成途径下调了的基因GA20和一个BR合成途径上调了的基因BR540分别构建过表达载体和RNAi干涉载体，把载体转入到突变体fj中，获得的转基因株系没有发生明显的表型差异，表明FJ基因间接调控了GA和BR相关基因的表达。为探索FJ基因是否参与了独角金内酯的代谢途径，分别与独角金内酯激素代谢途径相关突变体的d27和d88构建了双突变体，双突变体分蘖没有明显的变化，反卷叶也没有发生变化，表明FJ基因没有直接参与独角金内酯的代谢途径。