巴西橡胶树橡胶延伸因子REF138和REF258蛋白复合物的分离鉴定和功能分析

Rubber particles (RPs) is a special rubber biosynthesis organelle, rubber elongation factor (REF) is the most abundant protein on the membrane of RPs, and is involved in the biosynthesis of rubber molecules. REF aggregates on the RPs with itself or with small rubber particle protein (SRPP). In our previous results, we identified a new REF family member, REF258, which contains not only REF domain, but also a beta subunit of F-ATPase in its N-terminal. We also noticed the existence of other subunits of F-ATPase in RPs. The biosynthesis of rubber bio-macromolecule includes the processes of substrate transportation and energy usage, but how the two processes efficiently coordinate to perform rubber biosynthesis has been ignored for a long time. The discovery of REF258 links the energy utilization to rubber biosynthesis. We consider that the REF protein complexes on RPs membranes do not simply aggregate with itself or with SRPPs, and ATPase is likely to be involved in REF protein complexes. In this project, we choose the most abundant REF, REF138 and the F-ATPase beta subunit that contained REF, REF258, to identify and analyze their protein complex composition and detail function. The results will not only help us to clarify the special role of REF protein complexes in rubber biosynthesis, but also provide a new theoretical basis for further study of natural rubber biosynthesis.

橡胶粒子（RPs）是橡胶生物合成的细胞器，橡胶延伸因子（REF）是RPs膜上最丰富蛋白，参与了橡胶生物合成。REF在RPs上以聚合物形式存在，体外实验发现REF既可自身聚合也可与小橡胶粒子膜蛋白（SRPP）结合。我们在REF家族中发现了一个新成员REF258，它的N端存在F-ATPase的β亚基，同时我们还发现RPs上存在F-ATPase其它亚基。生物大分子合成中存在的底物运输和能量利用在橡胶生物合成研究中一直被忽视，REF258的发现将橡胶合成和能量利用联系到一起。我们认为，RPs膜上的REF聚合物不是简单的自身聚合或与SRPP聚合，ATPase有可能参与其中构成复杂的蛋白聚合物。本项目选择RPs中的REF138和具有ATPase β亚基的REF258，鉴定它们的蛋白复合物组成并分析功能，结果有助于阐明REF蛋白复合物在橡胶生物合成中的作用，为深入研究橡胶的生物合成提供新的理论依据。

橡胶粒子是天然橡胶生物合成的特殊细胞器，REF家族蛋白REF和SRPP是橡胶离子膜表面含量最大的两种蛋白，普遍认为REF与SRPP可能在橡胶粒子上形成了蛋白复合体，参与了橡胶的生物合成过程，但具体的构成和作用仍不清楚。在本项目研究中，我们利用橡胶粒子上含量最大的蛋白REF138和SRPP204及它们同家族的具有ATPase β结构域的REF258蛋白为切入点，希望能够发现橡胶粒子上REF蛋白复合物的组成及其怎么参与到橡胶的合成中。我们在研究中发现，REF蛋白复合物中，REF蛋白间通过REF结构域相互聚合。几种不同的REF蛋白，包括REF138，REF154,REF175,REF258,SRPP117,SRPP204,SRPP243都能被不同的REF和SRPP抗体免疫共沉淀捕获到，这说明它们共同组成了一个大的蛋白复合物。不同REF和SRPP成员也捕获到各自特有的结合蛋白，REF复合体中REF类蛋白和SRPP类蛋白的结合蛋白差异很大，目前已发现的REF类蛋白结合蛋白主要是参与膜脂结构的建成，REF类蛋白是仅仅通过参与橡胶粒子膜的结构建成支持橡胶在橡胶粒子上的合成，还是也会结合橡胶合成相关的蛋白只是未被鉴定到还有待进一步研究；REF复合物中的SRPP类蛋白结合蛋白包括了大量的乙酰辅酶A合成途径上的蛋白，REF复合物中的SRPP类蛋白通过参与橡胶底物合成的方式参与了橡胶合成。我们还发现REF类型的蛋白主要存在于橡胶粒子上，但SRPP类型蛋白则更多的存在于C乳清中，我们推测橡胶合成底物的合成有可能发生在C乳清中，也可能发生在橡胶粒子上，但最终都经由SRPP的作用结合到橡胶粒子的REF复合物上被进一步利用。通过该研究我们发现了橡胶合成前体的合成与REF蛋白复合物密切相关，但是橡胶的合成是否与REF蛋白复合物密切相关我们还将进一步研究。