基于整合素介导的力学信号转导途径研究手法治疗膝骨关节炎的作用机制

手法治疗膝骨关节炎的确切疗效已被临床研究广泛证实，但其作用机制尚未得到合理的阐释，因而制约了其客观化发展水平。力学刺激在关节软骨损伤修复中发挥重要作用，软骨细胞对力学变化也非常敏感，而手法作用的实质可能是通过间接的力学刺激阻止或延缓关节软骨退变。整合素介导软骨细胞力学信号转导与基因表达，是外力传向细胞骨架的通道。本项目拟建立兔膝骨关节炎模型并实施手法治疗，应用免疫组化等分子生物学技术方法检测软骨中整合素的表达、软骨细胞基质代谢的变化以及FAK和MAPK的mRNA和蛋白表达水平，并利用放置于关节内的压垫薄膜记录手法作用于关节软骨的力学数据，从力学信号转导角度研究手法对关节软骨产生的作用。结合体外实验，观察不同频率、大小和作用时间的机械应力刺激对软骨细胞的影响，以揭示软骨细胞整合素及瞬时受体电位通道亚单位在力学传导中的应答规律，为阐明手法治疗OA的作用靶点和作用机理提供依据。

中医手法治疗膝骨关节炎（KOA）临床疗效确切，能延缓关节软骨退变、促进软骨修复。本基金从整合素介导的力学传导途径切入，通过体内外研究探索力学因素对KOA软骨退变的影响。. 在体内，我们改良KOA Hulth模型，通过膝关节内侧间隙内置电薄膜力学传感设备，利用PowerLab采集施加手法时膝关节面受力情况，基本实现了手法力学参数客观化，并对模型进行手法干预。结果提示：1、改良的Hulth模型造模方法，基于关节力学失稳，且不进入膝关节腔，较之传统Hulth模型法能更好模拟KOA患者软骨退变机理；2、手法干预后，与模型组和跑台组比较，手法组关节软骨退变程度减轻及Mankin's评分降低；关节软骨中P38、ERK1、ERK2 mRNA表达和关节滑膜组织中IL-1β、iNOS、MMP-13 mRNA表达均不同程度下调； MMP-13、p-ERK1/2的蛋白活化程度被抑制。. 在体外，以体内实验中手法的力学参数为参考，设置低、中、高压力组，每组分设低、中、高频率组，观察压力对软骨细胞增殖作用及干预靶点。结果显示3 lbs、2Hz压力促进细胞增殖效果最明显，利用PEX100芯片对20余个信号通路的452个关键蛋白582个磷酸化位点进行比对，发现MAPK信号途径富集度排第二，ERK（ p44/42 MAPK）上调20%，提示压力激活软骨细胞整合素—MAPK通路。深入研究表明，炎症环境中软骨细胞增殖能力下降，p-ERK蛋白水平和Bcl-2/Bax表达降低；压力干预后细胞增殖能力增强，整合素浓度、ERK磷酸化水平和Bcl-2/Bax增高；加入ERK阻断剂后，整合素浓度升高，但p-ERK被抑制，Bcl-2/Bax表达减弱，细胞增殖能力降低。进一步观察不同作用时间压应力对软骨细胞代谢和MAPK通路关键指标的影响，结果提示干预后各组软骨细胞上清液中GAG浓度升高；压应力可以拮抗IL-1β引起的软骨细胞collagen ⅡmRNA下调，以及P38、ERK1、整合素α5、β1、MMP-13的mRNA水平上调。. 通过本基金，我们制备改良Hulth模型，实现手法参数客观化，证实手法可能通过抑制软骨MAPK 信号转导通路延缓KOA软骨退变。体外实验亦表明，适当压应力拮抗软骨细胞炎性损伤和退变，该作用与抑制软骨细胞整合素表达及其介导的MAPK信号转导通路密切相关。