基于插入事件扫描方法的黄龙病菌亚洲种种群多样性研究

Huanglongbing (HLB) is a destructive bacterium-associated disease in citrus production around the world. It seriously hampers sustainable development of citrus industry in China. Previous researches indicated that the main differences of genome sequences between different strains of Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) were contributed by prophage DNA. In this project, comparison of genome sequences, DNA fragment length polymorphism analysis, clone and sequencing will be carried out for screening insertion-deletion polymorphic sites of prophage DNA in the genome of Las, and insertion event scanning method of prophage DNA will be constructed subsequently. The established insertion event scanning method will be used to study the population diversity of Las in China. Effects of distinct environment and plant hosts on the evolution of Las will be estimated combining the information of geography, climate and plant hosts. This research can help us understand biological features of Las better, and provide new method for study of epidemiology of HLB. Furthermore, this research also can provide new insights for study of population genetics of other unculturable bacteria.

黄龙病(huanglongbing, HLB)是一种世界范围的柑桔毁灭性细菌病害，严重制约我国柑桔产业的可持续发展。前期研究发现，黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus, Las)不同株系基因组序列差异主要存在于前噬菌体DNA中。本项目拟通过基因组序列比较、DNA片段长度多态性分析及克隆测序等方法，在Las基因组中筛选前噬菌体DNA插入缺失多态性位点，并构建前噬菌体DNA插入事件扫描方法；然后运用插入事件扫描方法对我国Las的种群多样性进行研究，通过结合地理气候、寄主等信息，评估不同生态环境、寄主对Las进化的影响。本项目不仅可以加深我们对Las生物学特性的了解，还可为HLB流行病学研究提供新手段。此外，本项目也可为其它难培养植物病原细菌的种群遗传学研究提供新思路。

黄龙病是柑橘上的毁灭性细菌病害。我国黄龙病发生历史已有100余年，其病原为柑橘黄龙病菌亚洲种（Candidatus Liberibacter asiaticus，Las）。为加深对我国Las的了解，课题组开展了Las基因组插入缺失多态性位点的挖掘工作，并基于此建立了插入事件扫描方法，并用此方法对我国Las种群多样性进行了研究，具体结果如下：.（1）黄龙病样品收集：从云南、贵州、四川、广西、广东、海南、福建、江西及浙江采集了黄龙病样品338份，样品的采集同时兼顾了柚类、杂柑类、甜橙类和宽皮橘类等四类Las寄主。.（2）插入缺失多态性位点的挖掘：通过泛基因组学分析和PCR验证，从Las基因组上挖掘获得7个插入缺失多态性位点，分别命名为Indel-A（位于Las psy62株系（基因库登录号CP004005）基因组上第983990-983991位核苷酸之间），Indel-B（1134534-1134535位核苷酸之间），Indel-C（1081790-1081791位核苷酸之间）、Indel-D（507105-507253位核苷酸之间）、Indel-E（1182471-1182472位核苷酸之间）、Indel-F（1216885-1218420位核苷酸）和Indel-G（533490-533959位核苷酸之间）。.（3）基于插入事件扫描方法的遗传多样性分析：基于挖掘获得的7个插入缺失多态性位点建立插入事件扫描方法，并用该方法对收集的Las样品进行了分析。结果表明：插入事件扫描方法可将我国Las分成九种基因型，其中云南种群、贵州种群、四川种群、浙江种群均以基因型V为主，分别占各自种群的58.0%、62.1%、81.8%、62.5%；广西种群、广东种群、江西种群以基因型II为主，分别占各自种群的58.4%、62.2%、67.4%；福建种群以基因型II和基因型IV为主，分别占种群的33.3%和39.3%；海南种群以基因型IV为主，占种群的100.0%。进一步的UPGMA聚类分析表明，我国Las种群分为五个组，其中D组和E组类型的Las广泛分布于我国黄龙病疫区，而A组、B组及C组类型的Las只分布于局部地区。这些结果表明，我国Las在长期的进化过程中，已经产生明显的种内分化，且这种分化很可能与其所处的生存环境（包括地理气候）相关。但是，寄主对Las进化的影响并不清楚。