PinX1抑制端粒延长和肿瘤生成的结构基础和分子机制研究

PinX1 is the only identified protein that interacts with telomerase and inhibits telomerase activity, and is able to regulate telomere length and inhibit tumor formation. However, the molecular mechanism of PinX1 mediated by telomerase and TRF1 remains unclear. We have analyzed the structure information of interaction between PinX1 and TRF1, and found that PinX1 could inhibit the activity of telomerase complex in vitro, which lays a foundation for further exploring the molecular function and mechanism of PinX1. Therefore，this application project will analyze the crystal structure of PinX1, PinX1 and telomerase or TRF1 complexes, obtain the structure information of these crystals, and screen the critical regions and sites of PinX1 interacting with telomerase and TRF1, and inhibiting telomerase activity, analyze the relationship of their interaction and their co-location in vivo, and elucidate the structural basis and molecular mechanisms of PinX1 in maintaining telomere length and chromosome stability. On this basis, we will construct knock-in mice to confirm the function and molecular basis of PinX1 in inhibiting tumor occurrence and development. This application project will contribute to the study of telomere/telomerase regulation system, and promote the diagnosis and treatment of tumor.

PinX1是目前唯一确认的与端粒酶相互作用并抑制端粒酶活性的蛋白质，具有调控细胞端粒长度和抑制肿瘤的生成的作用。但是，PinX1通过端粒酶和TRF1发挥功能的分子机制仍然不清楚。我们已经解析了PinX1与TRF1结合区域的结构信息，并发现PinX1能在体外抑制端粒酶复合物的活性，这为深入探索PinX1的分子功能和机制奠定了基础。因此，本申请项目将通过解析PinX1，PinX1与端粒酶、TRF1的复合物的晶体结构，获取它们的结构信息，筛选PinX1与端粒酶和TRF1相互作用、抑制端粒酶活性的核心区域和位点，分析三者在体内的相互作用和共定位的关系，阐明PinX1维持细胞端粒长度和染色体稳定性的结构基础和分子机制。在此基础上，构建knock-in小鼠，确认PinX1抑制肿瘤发生、发展的功能及其分子基础。本相目的开展将有助于端粒/端粒酶调控体系的研究，并为肿瘤的诊断和治疗提供依据。

人体内除生殖细胞与干细胞以外，多数正常体细胞并不具有端粒酶活性，但是在约85%肿瘤中，端粒酶被重新激活延伸端粒长度，使细胞能够无限增殖。因此抑制肿瘤细胞的端粒酶活性，是一种可行的治疗策略。.本研究将PinX1作为对象，通过在体外分别纯化端粒酶与PinX1 C端蛋白质，进行pull down和TRAP实验，首次证明了PinX1能够在体外直接结合端粒酶，并抑制其活性。在此基础上，我们进一步地对PinX1不同截短体和突变体展开研究，发现PinX1203-328是保持最强抑制力的最短序列；PinX1290-328则保留了与端粒酶的结合能力，而且还是抑制后者活性的重要区域，其中K292，K294，K295和R297是其中关键氨基酸。晶体结构解析结果显示PinX1290-328也是PinX1蛋白与TRF1的主要结合区域。.对TCGA数据库进行分析显示，PinX1在泛癌中是一种潜在的抑癌因子，其中宫颈鳞癌较为明显。所以我们在Hela细胞系中敲低或过表达PinX1，证明了PinX1可以抑制肿瘤细胞干性相关特性。同时，我们构建并纯化了带有穿膜肽序列的PinX1 C端蛋白质（TAT-PinX1158-328-6×HIS，TPCH），证明它能够成进入细胞核。在此前对TPCH抑制肝癌细胞生长的研究基础上，进一步验证了其对多种端粒酶阳性肿瘤细胞的生长具有抑制效果，抑制效果与端粒长度成负相关。而端粒酶阴性细胞则不受TPCH处理的影响。最后，我们在多种细胞株移植瘤模型（CDX）和肝癌人源性组织异种移植瘤模型（PDX）中，每3天尾静脉注射TPCH（20 mg/kg）。发现在多种相对端粒长度较短的端粒酶阳性CDX中，均可以明显地抑制肿瘤生长；在端粒长度较短的端粒酶阳性PDX治疗组中，也有明显抑制肿瘤生长的效果。证明TPCH具有潜在的临床应有价值。