小分子3F1抑制血管新生的机制研究

血管新生是指从已存在的血管向外长出新血管的过程,是脊椎动物血管发生的主要方式。包括肿瘤在内，现在已知大约 70 种疾病跟血管新生紊乱相关。因此，研究血管新生具有基础理论和临床应用两方面的意义。以斑马鱼为主要模式动物，申请人在前期研究工作中筛选到了一个小分子化合物3F1特异性抑制血管新生：不仅抑制血管内皮细胞的增殖和迁移，而且还能引起已经形成的血管腔收缩至消失，最终导致血液循环停止。在哺乳动物实验体系中，3F1有同样的功能。目前，尚未有文献报道调节血管新生的信号通路能引起已形成的血管腔收缩至消失。用已知的血管新生抑制剂（SU5416等）来处理斑马鱼胚胎，不能产生相同的表型。这说明 3F1很可能作用了一个未知的调节血管新生的基因。本项目计划针对 3F1 所引起的表型展开研究，期待能够分离克隆其靶基因，找出其靶基因所处的信号转导通路，并进一步研究其在血管新生中的作用机制。

血管新生是指从已存在的血管向外长出新血管的过程，包括血管内皮细胞的增殖，迁移，和血管腔形成。血管新生是脊椎动物血管发生的主要方式，包括肿瘤在内，现在已知大约70种疾病跟血管新生紊乱相关。因此，研究血管新生具有基础理论和临床应用两方面的意义。以斑马鱼为主要模式动物，项目负责人在前期研究工作中筛选到了一个小分子化合物 3F1（3F1是筛选时的随机编号，此小分子的常用名是PP1，下文用PP1来表示） 特异性抑制血管新生：不仅抑制血管内皮细胞的增殖和迁移，而且还能引起已经形成的血管腔收缩至消失，最终导致血液循环停止。在体外培养的人脐静脉血管内皮细胞中，PP1有同样的功能。目前尚未有文章报道一种小分子能够引起已经形成的血管腔收缩消失，因此我们重点研究了PP1对血管腔维持的作用。电镜照片显示PP1引起血管内皮细胞膨大，失去正常的扁平鳞片状结构，而且细胞间的细胞连接也失去原有的形态，血管腔显著缩小。其中斑马鱼胚胎背部动脉的血管腔明显小于血细胞的直径，推测这是造成血液循环停止的主要原因。已知PP1是一种激酶抑制剂，为了探查PP1可能的靶点，我们选择了22种有代表性的激酶来检测PP1的抑制活性，结果显示PP1对Src激酶，VEGFR2（血管内皮生长因子受体2，一种激酶），和Abl激酶有较高的抑制活性。但是分别用这三种激酶和PDGFR（血小板衍生生长因子受体，也是一种激酶，已知跟血管新生相关）各自的特异性抑制剂来处理斑马鱼胚胎，不能产生同样的表型，这表明或者PP1另有特异性的靶点，或者PP1作为激酶抑制剂，是通过同时抑制多个激酶信号通路来起作用，我们分别设计实验来研究这两种可能性。亲和层析是目前最常用的分离小分子靶点的方法，PP1通过非活性位点结合到固相载体上，制备层析柱，用斑马鱼胚胎裂解液上柱层析，但是尝试过很多条件后，没有分离到特异性结合的条带。沿着另一条思路，用多个已知的非常特异的小分子激酶抑制剂来分析PP1的作用机制，我们发现同时抑制VEGFR2和MAP激酶能够引起已经形成的血管腔收缩，造成跟PP1相同的表型，因此说明PP1是通过同时抑制VEGFR2和MAP激酶信号通路来起发挥作用的。