番木瓜防癌抗癌成分BG生物合成相关基因克隆和功能鉴定

Isothiocyanates(ITCs), especially containing aromatic side chains, have good cancer-preventive and anticancer activities.ITCs can be synthesized or extracted from plants. There are some disadvantages in synthesis such as much toxicity of raw material, complex process and lower yield. Hydrolization and then extraction from natural materials which contain glucosinolates is the main method at present. But raw material and output are both limited, which restricted the usage of ITCs..My study reveals that there are much benzyl glucosinolates(BG) in Carica papaya L.seeds,which are widely grown in Hainan. BG can be hydrolyzed to benzyl isothiocyanate. Content of BG can be regulated by some related genes of BG biosynthesis pathway because of being product of secondary metabolism in plant. In this project, we firstly clone the related genes of BG biosynthesis in papaya by means of the sequence of papaya whole genome published in Nature, and secondly build RNAi vector containing hairpin structure and transfer it into protoplast of papaya, thirdly we detect the expression of target genes and content of BG in protoplast after culture. From their influence we can verify target gene function. .This study can provide theoretical basis for illustrating BG biosynthesis genes of papaya and further regulation of the synthesis of BG for the development of new BITC resources.

异硫氰酸酯类（ITCs）成分具有良好的防癌抗癌活性，但目前的开发利用尚处于初期，主要问题是其产量非常有限。ITCs合成所用的原料毒性大，工艺复杂，收率不高；目前以提取为主，利用含硫代葡萄糖苷的天然原料进行水解后提取，但原料和产量都较少。申请者在对番木瓜的研究中发现其种子有较高含量的苄基硫代葡萄糖苷（BG），可以水解生成异硫氰酸苄酯（BITC）。BG是植物的次生代谢产物，其含量受生物合成相关基因的调控。本项目借鉴模式植物拟南芥BG生物合成相关基因和番木瓜全基因组序列，克隆番木瓜BG生物合成相关的基因，然后构建含ihpRNA（发卡结构）的RNAi载体并转入番木瓜原生质体，检测原生质体中目的基因的表达对BG含量的影响，从而验证所克隆基因的功能。本研究将阐明番木瓜BG生物合成相关的6个基因，为进一步调控BG的合成、开发新的BITC中药资源奠定理论基础。前期工作表明本课题可行性良好。

热带水果番木瓜各组织中，除成熟果肉外，都存在着硫苷类物质——苄基硫代葡萄糖苷（BG），可以在芥子酶 (Myrosinase) 作用下水解产生具有防癌抗癌活性的异硫氰酸苄酯(BITC)。癌症，是人类健康的头号杀手，而异硫氰酸酯类物质对哺乳动物的抗癌防癌活性已经得到医学界的公认。番木瓜( Carica papaya L.) 是番木瓜科（Caricaceae）番木瓜属(Carica L.)多年生常绿大型草本植物。本项目选用番木瓜 “sunrise”品种作为研究材料，主要研究结果如下：.（1）通过系统的方法学研究，建立了高效液相色谱测定番木瓜中BG含量的方法，并且测定了番木瓜根、茎、叶、花、果实、种子中BG的含量。在番木瓜中，BG含量在种子中最高，达到4.7mol.g-1，其次是幼根和嫩茎，再次是嫩叶和花，成熟果肉中几乎检测不到。.（2）克隆得到番木瓜BG生物合成途径相关的6个基因。分别是：在BG合成的反应中，第一步由苯丙氨酸氧化生成苯乙醛肟的酶基因有2个，分别命名为CP-CYP79A2.1和CP-CYP79 A2.2；其余步骤分别只有一个基因，依次命名为CP-CYP83B, CP-C-S, CP-UDP-T以及CP-ST5a。.（3）利用Real-time QPCR技术，对克隆的6个基因在番木瓜不同组织器官的表达量进行了研究。BG相关的6个基因在幼根和嫩茎中的表达量都相对较高，在叶和花中的表达量相对较低，在种子中最低，果肉比种子略高。番木瓜BG合成相关的6个基因按根、茎、叶、花、果肉和种子的器官不同，总体呈表达量下降的趋势，即6个基因在种子中的相对表达量最低。而BG测定的结果却表明，种子中含量最高，果肉中几乎不存在。.（4）利用原生质体技术和RNAi技术，将构建的含ihpRNA发卡结构的载体通过PEG介导转入番木瓜叶肉原生质体细胞。培养48h后通过PCR检测和荧光定量分析，结果显示BG相关基因的表达量明显下调，原生质体中BG的含量也明显减少，证明各基因是BG生物合成相关基因。为番木瓜BG生物合成基因调控研究和BG的开发利用打下了良好的基础。