38K磷酸酶亚家族在杆状病毒衣壳装配中的分子机理研究

Baculoviruses have potential uses as bio-pesticides and has been commonly used as an expression vector system. Previous results from the applicant's group found that the baculovirus core gene 38K involved in the process of condensation of viral DNA into the capsid, but the molecular mechanism remains unclear. Conserved domain anslysis showed that the baculovirus 38K proteins constitutes a phosphatase subfamily. In this project we will try to express soluble 38K to determine its phosphatase activity; then, point mutations and deletion mutations will be carried out to identify the key amino acid residues and the auxiliary functional domain of the phosphatase. The protein P6.9 is the viral DNA-binding protein in nucleocapsid. Thus, assays of the phosphorylate state of P6.9 in 38K-null matant-infected cells will be performed to clarify whether the P6.9 is a substrate of 38K. Our previous results show that 38K interacts with a number of structural proteins, therefore we'll use the yeast two-hybrid assay and coimmunoprecipitation to analysis the structure of 38K so as to ultimately clarify the molecular mechanism of 38K. Our research will contribute to the further use of baculovirus expression system and the development of biological pesticides.

杆状病毒(Baculovirus)是有潜在应用前景的生物杀虫剂，也是常用的外源蛋白真核表达载体。申请人课题组的前期研究发现杆状病毒核心基因38K参与了病毒DNA压缩至衣壳的过程，但是其中的分子作用机理还不清楚。保守结构域分析表明杆状病毒38K蛋白构成一个磷酸酶亚家族。本项目拟表达并获得可溶性38K，检测其是否具有磷酸酶活性；然后，通过点突变和基因片段缺失突变确定38K的主要功能氨基酸位点和辅助功能域。研究38K缺失突变病毒感染细胞中病毒DNA结合蛋白P6.9的磷酸化状态，阐明P6.9是否是38K的作用底物。另外，我们前期的研究结果表明，38K可以和多个结构蛋白相互作用，因此我们还将利用酵母双杂交以及免疫共沉淀技术解析38K的结构和功能，最终阐明38K的分子作用机制。研究成果将有助于杆状病毒表达系统的进一步利用和生物杀虫剂的开发。

杆状病毒(Baculovirus)是有潜在应用前景的生物杀虫剂，也常用做外源蛋白真核表达载体。申请人的前期研究发现，杆状病毒保守基因38K参与了病毒DNA压缩至衣壳的过程，具有一个磷酸酶亚家族的保守结构域。病毒基因组装配至衣壳是病毒生命周期的基本过程。某些双链DNA病毒可编码带正电的碱性蛋白，中和DNA的负电荷，促进病毒基因组压缩至衣壳前体。而杆状病毒也编码一种小分子量的碱性蛋白（P6.9），该蛋白与脊椎动物的组蛋白/类鱼精蛋白同源，是病毒的核心蛋白。本项目研究目标是：鉴定38K磷酸酶亚家族的功能及结构特征，阐明38K在杆状病毒核衣壳装配过程中的分子作用机理。我们的研究结果表明：38K具有卤代酸脱卤酶超家族磷酸酶ⅢC的结构特征，P6.9是其底物。38K可去除P6.9的C端部分精氨酸和/或丝氨酸上的磷酸基团，导致P6.9更好地压缩病毒基因组至衣壳，完成病毒核衣壳的组装。本项目取得的重要结果具体如下：（1）利用质谱技术和醋酸尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术全面解析了P6.9的翻译后修饰及其超磷酸化；（2）病毒衣壳主要蛋白VP39需运输至病毒衣壳装配位点，即病毒发生基质，而次要衣壳蛋白VP1054参与该过程，38K与VP39和VP1054均能相互作用；（3）证明了38K可介导P6.9 C端的去磷酸化，且该过程是病毒核衣壳装配的重要步骤。这些成果将有助于杆状病毒表达系统的进一步利用和生物杀虫剂的开发。本项目共发表SCI论文8篇，其中第一标注的6篇，第二标注的2篇。在病毒学领域的国际顶级期刊《病毒学杂志》（Journal of Virology）发表了3篇，均为第一标注。此外，体现本项目最后阶段研究结果的论文也已投至《病毒学杂志》，目前处在小修阶段（Minor Revision）。我们还在国际无脊椎动物病理学协会第48届和第49届年会上分别在协会病毒学部做了口头报告。参与在本项目的5名研究生均已获得中山大学微生物学博士学位。