PHLPP2结合HSF-1调控MDR-1活性逆转结直肠癌多药耐药的分子机制研究

Multidrug resistance gene 1(MDR-1) is highly expressed in colorectal cancer (CRC) and plays a major role in multidrug resistance, being a severe problem in cancer treatment. Our previous study has demonstrated that activation of PHLPP2 could reduce the expression level of HSF-1 and MDR-1, indicating that PHLPP2 may reverse MDR through regulating the expression of HSF-1 and MDR-1. However, the underlying mechanism of PHLPP2 on MDR remains unclear. We will clarify the regulating mechanism of PHLPP2-HSF-1-MDR-1 axis and its influence on MDR through gene transfection, Co-IP, Luciferase, ChIP and drug intervention in different CRC cell lines. In vivo, we will observe the impact of PHLPP2 expression level on the MDR of colorectal cancer nude mice xenograft. Finally, we will detect PHLPP2-HSF-1-MDR-1 expression through IHC. Western-blot and qRT-PCR in clinical specimen, analyse the significance of PHLPP2 on MDR and its prognosis in colorectal cancer. Our study will clarify the role of PHLPP2-HSF-1-MDR-1 regulation axis, and this will have a significant impact for the reversal of clinical multidrug resistance.

结直肠癌（CRC）中多药耐药基因-1（MDR-1）高表达并与肿瘤的多药耐药相关，成为肿瘤治疗的重大难题。我们前期研究发现激活PHLPP2能下调HSF-1与MDR-1的表达，提示PHLPP2可能通过结合HSF-1抑制MDR-1。但目前国内外研究对PHLPP2影响肿瘤多药耐药性的作用机制并不清楚。本课题将在体外不同CRC细胞株中通过基因转染、Co-IP、ChIP、荧光素酶报告实验和药物干预等方法，明确三者的调控关系以及对细胞生物学行为和耐药的影响；通过裸鼠移植瘤实验在体内观察PHLPP2的激活或抑制对CRC多药耐药的影响；在临床大样本中应用IHC、qRT-PCR等技术检测PHLPP2、HSF-1和MDR-1的表达特征，分析PHLPP2对于结直肠癌MDR的临床意义以及判断预后和应用价值。本研究将明确CRC中PHLPP2-HSF-1-MDR-1轴的调控机制，对于逆转CRC多药耐药具有重要意义。

本课题以PHLPP2 、HSF-1与MDR-1 /DPD调控轴与肿瘤发生发展及耐药为中心，应用生物信息学技术、细胞学实验、动物实验，同时在临床样本中开展了大量的相关研究，研究结果显示：（1）应用生信在TCGA 数据库的CRC 临床资料中筛选出与预后相关的目标基因，应用R语言分析其在肿瘤和癌旁组织中的表达差异，并与前期研究筛选出的7个具有预后价值的基因作交集后，筛选出具有相互作用的关键基因PHLPP2、HSF-1、MDR-1、 DPD。采用GST-pulldown、Co-IP实验验证，结果表明PHLPP2、HSF-1 和MDR-1间存在相互关系。（2）通过细胞实验，检测多株结直肠癌细胞中PHLPP2、LC3、HSF-1、MDR-1、DPD的基础表达量，筛选了HCT-8、CHT-8/5FU、HCT-116做为实验研究对象。通过构建Lenti-shPHLPP2 、Lenti-sh HSF-1、MDR-1的慢病毒载体，分别转染目标细胞，结果显示PHLPP2对HSF-1及、MDR-1、DPD存在调控关系，并可影响细胞生长、增殖、凋亡、侵袭和耐药等生物学行为。联合化疗药物干预，结果显示 MDR-1、P-gp 表达改变、细胞耐药指数、生长曲线、荧光强度以及细胞生物学行为变化存在显著相关性。（3）通过动物实验，观察体内裸鼠移植瘤调控 PHLPP2 、HSF-1及联合应用MDR-1 靶向抑制剂对裸鼠CRC 移植瘤形成、生长以及化疗药物敏感性的影响，结果显示，PHLPP2 、HSF-1与MDR-1 /DPD调控轴可影响肿瘤耐药性，靶向干预具有逆转耐药的可行性。（4）临床实验，通过搜集结直肠癌患者例的临床资料，将获得具有完成随访资料的样本分组研究，检测CRC组织中PHLPP2、HSF-1、MDR-1、DPD蛋白和mRNA表达，分析其表达特征及其与患者临床病理特征和预后相关性。结果显示，CRC 组织中PHLPP2、HSF-1 和MDR-1与DPD的表达特征与患者的临床病理因素、预后、耐药均具有相关性，具有重要临床意义，为其深入研究提供了重要的研究基础。.在项目执行期间，发表了高水平学术论文16篇，其中SCI收录7篇，申请国家发明专利3项，已授权2项；副主编教材一部，培养研究生15人。