Tip60的SUMO-2/3修饰在放射损伤诱发的细胞周期G2/M检查点调控中的作用及其机制研究

Tip60, a very conserved acetyltransferase from yeast to mammalian cells, was proved to play very important role in DNA damage repair reponse. Our research has demonstrated that Tip60 interacts directly with Cyclin B1 and Plk1 and forms ternary complex to co-localize with them in centrosome of mitotic cells. It is the first time that Tip60 was found to participate in cell cycle control directly. As a post-translational modification, sumoylation was revealed to play essential roles in multiple signaling pathways,including DNA damage repair response. We found that Tip60 could be modified by SUMO-2/3 which is induced by ionizing radiation. Based on our previous work and these concepts, we plan to conduct the following research:1.Identification of the SUMO-2/3 modification site in Tip60; 2.Confirming the E3 ligase and deSUMOylation enzyme; 3.Confirming the sub-cellular localization of Tip60, SUMO-2/3, E3 ligase and deSUMOylation enzyme before and after different doses of γ-ray radiation; 4.investigate the role of Tip60 SUMO-2/3 modification in cell cycle control and radiation induced cell cycle G2/M chechpoint activation and the detailed mechanism. After fulfilling these aims, we will demonstrate the effect and molecular mechanism of Tip60 SUMO-2/3 modification in cell cycle G2/M checkpoint activation and further paved the way to deeply reveal the mechanism of genome stability of radiation damaged cells and to develop new-concept radiation protection drugs.

Tip60是一个从酵母到哺乳动物高度保守的乙酰基转移酶，在DNA损伤修复中发挥着重要作用。我们前期研究发现，Tip60与细胞周期G2/M期关键调节分子Cyclin B1、Plk1存在直接的相互作用，并形成三元复合体定位到有丝分裂的中心体上，放射损伤也可诱导Tip60的SUMO-2/3化修饰。基于以上结果，我们拟开展以下研究：1.确定Tip60发生SUMO-2/3修饰的位点；2.确定Tip60 SUMO-2/3修饰的E3连接酶及去SUMO化酶；3.Tip60与SUMO-2/3、E3连接酶及去SUMO化酶在γ射线照射之后亚细胞定位及动态变化；4.Tip60的上述修饰对γ射线诱导的G2/M期检查点激活的调控机制。通过该课题研究，不仅可以阐明SUMO-2/3修饰对Tip60参与细胞周期调控及细胞周期检查点激活的调控机制，还可以为深入揭示放射损伤细胞基因组稳定性的调节机制及辐射防护提供新的理论基础。

结题摘要：. 研究背景:SUMOlation是一种类泛素化修饰，越来越多的参与DNA损伤修复的蛋白被发现存在SUMO化修饰，比如：BRCA1、53BP1、PCNA、XPC、Rad52、BLM、Ku70等。PIAS1、PIAS4介导的SUMO化可调节BRCA1、53BP1募集到DNA损伤位点，RPA的SUMO化修饰可通过招募Rad51从而促进HR修复。影响其同源重组修复活性，但是大部分的SUMO化修饰在DNA损伤修复中的功能还不清楚。Tip60是一种乙酰基转移酶，DNA双链断裂后，Tip60通过乙酰化H3、H4以及γH2AX，从而使染色质松弛并发生重构，Tip60乙酰化ATM是ATM激活所必需的。我们的前期的研究结果表明，Tip60可被SUMO-2/3修饰，并且与PLK1、CyclinB1形成三元复合物。上述结果提示Tip60的SUMO-2/3修饰可能对DNA损伤后的细胞周期阻滞以及ATM的激活具有调节作用。研究结果：1、研究发现，Tip60存在SUMO-2/3修饰，并更容易被SUMO-3修饰，二者存在细胞共定位。DNA损伤后，该修饰明显减弱，并且Tip60与SUMO-2/3共定位到DNA损伤位点，说明TIp60的SUMO-2/3修饰极有可能在DNA损伤修复中发挥功能。2、免疫共沉淀与免疫荧光结果证实，Tip60与SUMO化修饰的E1酶SAE1、SAE2存在相互作用与细胞共定位。UBC9、PIAS4分别SUMO化修饰的E2、E3，已有文献报道二者在DNA损伤修复中发挥着重要功能。我们发现，Tip60与UBC9在DNA损伤位点形成共定位；Tip60与PIAS4存在相互作用与细胞共定位，SUMO化的Tip60主要定位在PML小体之内，但是PIAS4可以导致Tip60的定位发生改变，PIAS4很可能通过改变Tip60 SUMO化修饰的模式来影响其定位。3、对Tip60 SUMO-2/3修饰的E3连接酶，De-SUMOlase以及修饰位点筛选结果证实，Tip60与SENP1、SENP3有很强的相互作用与细胞共定位，与SENP2、SENP5、SENP6的相互作用较弱,SENP1、SENP3极有可能是它的De-SUMO酶。Tip60的K430（B）位点突变为精氨酸后，其SUMO-2/3化修饰明显减弱，说明该位点对其修饰具有重要的调节作用。对其E3连接酶的筛选工作发现，Tip