NF-κB促进LOC401296基因转录在电离辐射诱发细胞G2/M检查点调控中的作用及机制研究

Activation of G2/M checkpoint induced by radiation is one of the important mechanism to maintain genome stability. NF-κB activated by radiation plays a role in DNA damage repair and maintenance of genomic stability. But the relationship between NF-κB activation and G2/M checkpoint is unclear. Our previous study found that LOC401296 expression was induced by radiation and involved in activation of G2/M checkpoint. Over-expression of NF-κB (p65) up-regulate expression of LOC401296. We believe that activation of NF-κB induced by radiation plays a role in activation of G2/M checkpoint via up-regualtion of LOC401296.To prove this hypothesis , the following three scientific issues to be studied: 1.Is LOC401296 expression response to radiation mediated by activation of NF-κB ? 2. Dose activation of NF-κB induced by radiation play a role in activation of G2/M checkpoint and genome stability via up-regualtion of LOC401296? 3. The mechanism of LOC401296 in activation of G2/M checkpoint? Through this study ， the NF-κB function in the cell radiation damage response will be expended and the new regulatory mechanisms of G2 / M checkpoint will be clarified

放射损伤后细胞G2/M检查点激活是维持基因组稳定性重要机制之一。NF-κB受到电离辐射激活， 在DNA损伤修复和维持基因组稳定性中发挥作用，但是NF-κB活化与G2/M检查点的关系还不清楚。前期研究发现LOC401296基因为辐射诱导，参与辐射后细胞G2/M检查点调控，并证实LOC401296受到NF-κB（p65）的直接转录调节。我们推测电离辐射活化NF-κB可能通过上调LOC401296表达，调节G2/M检查点。拟从三个方面研究，证实上面设想：1)NF-κB是否介导电离辐射诱导LOC401296表达？2)电离辐射后NF-κB活化是否会通过LOC401296分子参与G2/M检查点的调控及基因组稳定性的维持？3)NF-κB/LOC401296信号通路调控G2/M检查点的分子机制是什么？ 通过本研究将拓展NF-κB在细胞放射损伤反应中的调节功能和G2/M检查点调节机制新的认识。

放射致细胞周期阻滞是影响细胞辐射敏感性的重要因素，开展放射致细胞G2/M期阻滞的调控对于进一步阐明细胞辐射敏感性和放射致基因组稳定性的研究具有重要的科学意义。LOC401296分子是一种功能未知的分子，本研究开展电离辐射对LOC401296分子表达的调控作用，并探索LOC401296分子对细胞G2/M的调控作用及对细胞放射敏感性的影响。本项目主要研究发现：1.细胞受到不同剂量γ射线照射后，LOC401296表达水平呈现剂量依赖性增加，发现NF-kB（P65)激活和表达促进LOC401296的表达，在照射前采用NF-kB的抑制剂Bay11-7085预处理细胞可以有效抑制γ射线对LOC401296表达促进作用，通过报告基因结合定点突变分析以及ChIP实验发现并证实NF-kB（P65)结合LOC401296启动子区域的结合位点序列。2.采用慢病毒系统建立LOC401296敲低表达的HeLa细胞系，通过分析不同剂量照射后的细胞克隆形成能力，发现并证实敲低LOC401296表达增强细胞的放射敏感性。3.发现并证实敲低LOC401296可以引起细胞发生G2/M期阻滞，进一步机制研究发现LOC401296下调导致细胞纺锤体结构和形态异常，从而导致G2/M期阻滞。进一步研究发现，LOC401296下调显著抑制有丝分裂调控分子PLK1 mRNA和蛋白的表达，回转LOC401296后可解除LOC401296下调引起的细胞周期阻滞。机制研究发现LOC401296 RNA与PLK1 mRNA 3'UTR区域竞争性结合miRNA-210-3p分子，并发现和确认miRNA-210-3p结合LOC401296 RNA的位点序列。本研究首次阐述LOC401296分子的生物学功能，发现并证实LOC401296调节细胞放射敏感性以及对细胞周期G2/M期阻滞的调节作用，证明PLK1作为LOC401296的下游靶分子参与其细胞周期调控功能。