从对炎症通路的影响探讨藏药波棱瓜子及其有效成分抗免疫肝损伤的作用及机制

Based on the results of the previous studies, we enriched three bioactive monomers from the effective parts of lignans in Herpetospermum Caudigerum, namely herpetin, herpetrione and herpetfluorenone. A series of modern separation and analysis methods were used, such as IR、UV、HPLC-MS、HPLC and NMR. This research focuses on the differences between the effects of the three monomers and the effective parts on immunologic liver injury, and attempts to confirm the optimizing effective components. The model of ILI were induced by ConA, BCG plus LPS in mice. We investigated the model of ILI under pathological conditions, to explore the regulation on related cytokines by signal transduction pathway(TNF-α/NF-κB and IFN-γ/STAT1 ),and the effects of effective parts or components in Herpetospermum Caudigerum on TNF-α/NF-κB and IFN-γ/STAT1. Then we made a further discussion on the molecular regulation mechanism of correlation factors which cause the unbalanced expression in hepatic immune inflammation, in order to search for the pharmacological basis of clinical effect on liver protection.

我们前期研究表明，临床常用藏药波棱瓜子具有抗病毒和抗免疫肝损伤双重作用，作用特色显著。本项目拟首先开展其抗免疫肝损伤的有效物质基础及作用机理研究：即通过整体动物实验，采用刀豆蛋白A(ConA)和卡介苗(BCG)+脂多糖(LPS)模型动物，研究上述有效部位（总木脂素部位）和单体成分(波棱素、波棱酮和波棱芴酮)抗免疫性肝损伤作用差异，确认其有效成分；并进一步探讨有效成分对TNF-α/NF-κB及IFN-γ/STAT1信号转导通路调控影响，对黏附因子及趋化因子的表达作用，阐明其抗免疫性肝损伤作用靶点和其调控肝脏免疫炎症因子表达失衡的分子作用机制，寻找波棱瓜子临床保肝疗效的药理学基础。

本项目建立不同肝损伤动物模型和肝细胞损伤模型，分别观察波棱瓜子总木脂素部位和单体成分波棱素对免疫性肝损伤的药效保护作用，并探讨其对TNF-α/NF-κβ及INF-γ/STAT1等信号通路的调控机制，为波棱瓜子的临床保肝疗效提供科学依据。在此基础上，课题组又进一步探讨了三种单体成分波棱素、波棱酮和波棱芴酮的体外抗乙肝病毒作用，并对其波棱素脂质体给药系统进行了探索性研究。研究结果如下：. （1）波棱瓜子总木脂素部位对CCl4致小鼠化学性肝损伤、以及ConA和BCG+LPS分别诱导的小鼠免疫性肝损伤具有明显的保护作用，药物能明显改善不同肝损伤模型的肝功能指标，减轻其肝脏组织病变程度，显示出确切的改善肝功能、抗肝损伤作用。作用机制可能与以下几方面有关：① 抗脂质过氧化，清除自由基；② 调节Th1/Th2平衡，抑制炎性因子，促进抗炎性因子表达，减少炎性细胞在炎症和组织损伤区域的聚集；③ 通过T淋巴细胞的免疫调节，调节细胞凋亡。.（2）波棱瓜子成分波棱素对原代肝细胞损伤模型、以及ConA和BCG+LPS分别诱导的小鼠免疫性肝损伤具有明显的保护作用，能明显降低不同模型的肝功能指标，并减轻动物模型肝脏组织的病变程度，显示出确切的改善肝功能、抗肝损伤作用。作用机制可能与药物抗氧化，调节免疫系统，以及降低炎性细胞因子的损伤应答来发挥作用。上述结果也证明了波棱素是波棱瓜子抗肝损伤的确切有效成分之一。.（3）波棱瓜子三种单体成分波棱素、波棱酮和波棱芴酮体外抗乙肝病毒作用实验显示，三种单体成分对HepG2.2.15细胞均有不同程度的毒性，抑制其细胞增殖；其中波棱素和波棱芴酮对HBV的复制具有较强的抑制作用，该作用于药物抑制HBV病毒DNA的复制有关；而波棱酮细胞毒性较大，治疗较差。.（4）波棱素脂质体给药系统初步探索性研究显示，波棱素脂质体最佳制备工艺为：波棱素：大豆磷脂：胆固醇=2.44：78.05：19.51，选用0.5% F68溶液进行50℃水合脱膜，水浴超声时间为20 min。制备得到的波棱素脂质体平均包封率为94.50±2.15%，粒径为119.2±10.7 nm，其体外释药试验显示24 h内累计释放量为88.31%，72 h基本释放完全；药效实验也表明波棱素脂质体冻干粉针具有确切的抗肝损伤作用，疗效优于原药，且无明显溶血和红细胞聚集反应，静脉注射对血管亦无明显影响。